DHPR和RyR及細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的改變?cè)诖笫竽摱狙Y動(dòng)物模型中對(duì)膈肌功能障礙的影響.pdf

1、目的：膿毒血癥(sepsis)是由感染引起的一系列生理、病理、生化異常綜合征。據(jù)報(bào)道膿毒血癥發(fā)病率的增加與人口的老齡化、對(duì)膿毒血癥疾病的認(rèn)知增加、醫(yī)療報(bào)銷有利等原因相關(guān)。盡管膿毒血癥準(zhǔn)確的發(fā)病率尚未清楚，但是在全球范圍內(nèi)保守估計(jì)膿毒血癥是導(dǎo)致重大疾病和死亡的原因之一。此外，人們?cè)絹碓揭庾R(shí)到，膿毒血癥患者即使存活下來，通常也會(huì)伴有身體、心理、和認(rèn)知障礙，造成巨大健康保健負(fù)擔(dān)和社會(huì)隱患。因此研究膿毒血癥的發(fā)病機(jī)制對(duì)于改善膿毒血癥的治療方案有

2、著重要意義。嚴(yán)重的膿毒血癥患者病死率高達(dá)30％-50％，而呼吸衰竭是膿毒血癥常見的死亡原因。引起呼吸衰竭主要有兩方面因素，一方面是肺臟的損傷，另一方面是呼吸肌肉的損傷。以往的研究主要集中于由肺臟的損傷引起的呼吸衰竭，而忽略了呼吸肌肉的功能障礙引起的呼吸衰竭。膈肌是人體重要的呼吸肌，提供呼吸動(dòng)力的60％-80％，因此在膿毒血癥的發(fā)病機(jī)制中研究膈肌功能障礙非常關(guān)鍵。以往的研究報(bào)道膿毒血癥導(dǎo)致膈肌功能障礙的原因有:線粒體功能障礙、膈肌的病理學(xué)

3、改變、膈肌細(xì)胞的氧化損傷、細(xì)胞因子作用及氧化應(yīng)激損傷。然而，骨骼肌的收縮依靠興奮收縮耦聯(lián)的發(fā)生，細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的改變是誘發(fā)骨骼肌興奮收縮耦聯(lián)的關(guān)鍵。在骨骼肌中，細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的改變依靠存在于細(xì)胞膜凹陷形成的T管上的L型鈣通道(DHPR)與位于肌漿網(wǎng)膜上的蘭尼堿（ryanodine）受體鈣釋放通道(RyR)的耦聯(lián)。有研究報(bào)道在骨骼肌中，細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的改變可直接影響骨骼肌的收縮力，而膈肌是骨骼肌的一種，所以細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度是膈肌收縮

4、的關(guān)鍵。然而，在膿毒血癥時(shí)膈肌細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的變化并不清楚。L型鈣通道(DHPR)和蘭尼堿(ryanodine)受體鈣釋放通道(RyR)是橫紋肌興奮收縮耦聯(lián)的重要組成部分。DHPR分為骨骼肌(DHPRα1s)和心肌(DHPRα1c)型。RyR分為骨骼?。≧yR1），心肌(RyR2)和腦與平滑肌(RyR3)同種型。有研究報(bào)道組成膈肌興奮收縮耦聯(lián)的DHPR和RyR的主要類型為DHPRα1s和RyR1。本實(shí)驗(yàn)首先制備大鼠膿毒血癥動(dòng)物模型，評(píng)

5、價(jià)膿毒血癥誘導(dǎo)的膈肌的收縮功能，觀察膈肌組織的病理學(xué)改變，其次研究興奮收縮耦聯(lián)膈肌DHPRα1s和RyR1的分布和共定位情況，最后探索膈肌細(xì)胞的急性分離方法及膈肌細(xì)胞內(nèi)鈣離子的變化，膈肌細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的改變與鈣釋放相關(guān)通道DHPRα1s和RyR1蛋白表達(dá)水平及膈肌功能之間的關(guān)系，旨在闡明膿毒血癥誘導(dǎo)膈肌功能障礙的核心機(jī)制。
　　方法：⑴大鼠膿毒血癥動(dòng)物模型的制備評(píng)價(jià)。實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物腹腔注射LPS建立大鼠膿毒血癥動(dòng)物模型，并監(jiān)測(cè)對(duì)照組

6、和實(shí)驗(yàn)組大鼠的呼吸頻率、平均動(dòng)脈血壓、肺組織病理學(xué)改變、肺組織水腫情況及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的死亡率。⑵膈肌離體收縮力的測(cè)定。采用刺激儀（Grass S88; Astro-Med，West Warwick，Rhode Island，USA）0.5ms單脈沖方波刺激離體膈肌條，每次刺激間隔2分鐘，測(cè)量膿毒血癥組和對(duì)照組的大鼠膈肌峰抽搐壓力(Pt/CSA)、不同刺激頻率與收縮力的關(guān)系曲線、疲勞指數(shù)(FI/CSA)。⑶膈肌的形態(tài)學(xué)觀察。采用光學(xué)顯微鏡和電

7、子顯微鏡技術(shù)觀察膿毒血癥組和對(duì)照組的大鼠膈肌的大體形態(tài)學(xué)變化和超微結(jié)構(gòu)的改變。⑷鈣釋放蛋白DHPRα1s和RyR1的蛋白表達(dá)水平和DHPRα1s與RyR1共定位。采用免疫組化和免疫熒光的方法檢測(cè)鈣釋放蛋白DHPRα1s和RyR1的蛋白表達(dá)水平和DHPRα1s與RyR1共定位。⑸膈肌細(xì)胞的體外急性分離。采用膠原酶消化膈肌組織的方法對(duì)膿毒血癥組和對(duì)照組的大鼠膈肌細(xì)胞進(jìn)行體外急性分離。⑹膈肌細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的測(cè)定。采用共聚焦和熒光分光光度計(jì)的

8、方法檢測(cè)膿毒血癥組和對(duì)照組的大鼠膈肌細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度。
　　結(jié)果：①大鼠膿毒血癥動(dòng)物模型的制備評(píng)價(jià)：sepsis組平均動(dòng)脈壓較對(duì)照組相比明顯下降（P＜0.05）；sepsis組呼吸頻率較對(duì)照組相比無明顯改變(P＞0.05）；sepsis組肺組織損傷評(píng)分明顯較對(duì)照組增高(P＜0.05），結(jié)果表明，膿毒血癥會(huì)導(dǎo)致肺組織損傷；sepsis組肺組織的濕/干重比明顯較對(duì)照組增高（P＜0.05）。結(jié)果表明，膿毒血癥會(huì)導(dǎo)致肺組織水腫；sepsi

9、s24h實(shí)驗(yàn)動(dòng)物死亡率為43％。②膈肌離體收縮力的測(cè)定：在大鼠膿毒血癥動(dòng)物模型中，與對(duì)照組相比，膿毒血癥組膈肌的峰抽搐壓力Pt顯著降低(P＜0.05);在不同刺激頻率(10Hz，20Hz，30Hz，40Hz，50Hz，75Hz，100Hz)均顯著減弱(P＜0.05);疲勞指數(shù)顯著降低(P＜0.05)。③膈肌的形態(tài)學(xué)觀察：在大鼠膿毒血癥動(dòng)物模型中，與對(duì)照組相比，采用光鏡觀察膈肌的結(jié)構(gòu)無明顯改變，采用電子顯微鏡觀察膈肌的超微結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)膈肌的正

10、常肌纖維NMF體積分?jǐn)?shù)沒有改變(P＞0.05)，膈肌的正常線粒體NSR的體積分?jǐn)?shù)顯著降低(P＜0.05)，膿毒血癥組的膈肌纖維沒有明顯破壞，但肌漿網(wǎng)出現(xiàn)了明顯改變。④膈肌的鈣釋放蛋白R(shí)yR1和DHPRα1s的蛋白表達(dá)水平：在大鼠膿毒血癥動(dòng)物模型中，與對(duì)照組相比，膿毒血癥組膈肌的鈣釋放相關(guān)蛋白R(shí)yR1和DHPRα1s的OD值出現(xiàn)顯著降低，即RyR1和DHPRα1s的表達(dá)降低。⑤膈肌的鈣釋放相關(guān)蛋白R(shí)yR1和DHPRα1s的分布及共定位關(guān)系

11、：在大鼠膿毒血癥動(dòng)物模型中，RyR1彌漫分布在肌節(jié)中間，而DHPRα1s分布在肌膜。與對(duì)照組相比，在膿毒癥組中，指示RyR1和DHPRα1s的共定位的Manders的重疊系數(shù)沒有顯著變化(P＞0.05)。⑥膈肌細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的測(cè)定：通過共聚焦顯微鏡測(cè)量細(xì)胞內(nèi)鈣離子平均熒光強(qiáng)度，結(jié)果顯示在大鼠膿毒血癥動(dòng)物模型中，與對(duì)照組相比，膿毒血癥組膈肌細(xì)胞內(nèi)鈣離子的平均熒光強(qiáng)度顯著降低（P＜0.05）。通過熒光分光光度計(jì)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度，結(jié)果顯

12、示在大鼠膿毒血癥動(dòng)物模型中，與對(duì)照組相比，膿毒血癥組膈肌細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度顯著降低(P＜0.05)。⑦膈肌細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的改變與下降的膈肌收縮力的關(guān)系：大鼠膿毒血癥動(dòng)物模型中細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的改變與下降的膈肌收縮力的呈直線相關(guān)關(guān)系（P＜0.01）。⑧膈肌細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的改變與降低的鈣釋放相關(guān)蛋白R(shí)yR1和DHPRα1s的表達(dá)之間的關(guān)系：大鼠膿毒血癥動(dòng)物模型中細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的改變與降低的鈣釋放相關(guān)蛋白R(shí)yR1和DHPRα1s的表達(dá)呈直

13、線相關(guān)關(guān)系(P＜0.01)。
　　結(jié)論：⑴大鼠膿毒血癥動(dòng)物模型中膈肌的離體收縮力下降。⑵大鼠膿毒血癥動(dòng)物模型中膈肌肌節(jié)無明顯改變，肌漿網(wǎng)出現(xiàn)腫脹。⑶大鼠膿毒血癥動(dòng)物模型中DHPRα1s和RyR的蛋白表達(dá)下降。⑷大鼠膿毒血癥動(dòng)物模型中DHPRα1s和RyR1蛋白的分布和共定位無明顯改變。⑸大鼠膿毒血癥動(dòng)物模型中膈肌細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度降低。⑹大鼠膿毒血癥動(dòng)物模型中，減少的膈肌細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度與DHPRα1s和RyR1蛋白表達(dá)的降低及膈肌