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文檔簡介
1、ABL在腦缺血中的抗炎作用是否是通過調(diào)制miR-155表達(dá)而實現(xiàn)的,目前仍不清楚。本研究將分三部分對上述問題進行探討,現(xiàn)將各部分內(nèi)容概述如下:
第一部分 旋覆花內(nèi)酯對小鼠腦缺血誘發(fā)的炎癥反應(yīng)的影響
目的:觀察ABL在缺血性腦損傷中的抗炎作用。
方法:選用成年雄性CD1小鼠,采用改良線栓法制備MCAO小鼠模型。將CD1小鼠隨機分為5組:假手術(shù)組(sham)、模型組(MCAO)、ABL小劑量組(ABL-L)、A
2、BL中劑量組(ABL-M)、ABL大劑量組(ABL-H)。
將BV2小膠質(zhì)細(xì)胞分為對照組(con)和氧糖剝奪處理組(OGD),氧糖剝奪處理組再分為用ABL(100μmol/L)預(yù)處理24 h和不用ABL預(yù)處理組。ABL預(yù)處理組預(yù)先用100μmol/L的ABL預(yù)處理BV2小膠質(zhì)細(xì)胞24 h。
腦缺血后24 h處死動物進行觀察、檢測。
結(jié)果:
1.神經(jīng)功能評分:MCAO組明顯高于sham組(P<0.0
3、5);ABL處理后,ABL-M組與ABL-H組神經(jīng)功能評分明顯低于MCAO組(P<0.05);但ABL-L組與MCAO組比較無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。
2.腦組織水含量:MCAO組明顯高于sham組(P<0.05);ABL處理后,ABL-H組和ABL-M組腦組織含水量明顯低于MCAO組(P<0.05),ABL-L組腦組織含水量與MCAO組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。
3.腦梗死體積:sham組表現(xiàn)為均勻一致
4、的紅色,MCAO組出現(xiàn)大范圍蒼白色梗死區(qū)域。ABL處理后,大、中、小三個劑量組蒼白色梗死區(qū)域體積均縮小。
4.ABL減輕了小鼠局灶性腦缺血損傷后的炎癥反應(yīng)。
5.ABL通過抑制TLR-4/NF-κB信號通路減輕炎癥反應(yīng)。
結(jié)論:ABL可顯著改善局灶性腦缺血損傷后小鼠神經(jīng)功能缺損,減輕腦水腫,減小梗死體積,起到神經(jīng)保護作用;ABL通過抑制腦缺血引發(fā)的TLR4/NF-κB信號級聯(lián)減少TNF-α、IL-1β的表達(dá)
5、,同時通過上調(diào)TLR4/NF-κB途徑中的負(fù)調(diào)節(jié)因子MyD88和SOCS-1表達(dá),發(fā)揮對腦缺血損傷的抗炎作用。
第二部分 miR-155在缺血性腦組織中的表達(dá)及旋覆花內(nèi)酯對miR-155表達(dá)的影響
目的:觀察miR-155是否參與缺血腦組織的炎癥反應(yīng),以及ABL是否通過調(diào)節(jié)miR-155的表達(dá)來發(fā)揮抗炎作用。
方法:
實驗1:選用成年雄性CD1小鼠,采用改良線栓法制備MCAO小鼠模型。將CD1小鼠
6、隨機分為5組:假手術(shù)組(sham)、模型組(MCAO)、ABL小劑量組(ABL-L)、ABL中劑量組(ABL-M)、ABL大劑量組(ABL-H)。將BV2小膠質(zhì)細(xì)胞分為對照組(con)和氧糖剝奪處理組(OGD),再分為用ABL(100μmol/L)預(yù)處理24 h和不用ABL預(yù)處理組。用qRT-PCR和報告基因方法檢測腦組織和BV2細(xì)胞中miR-155的表達(dá)。
實驗2:選用8周齡雄性miR-155基因敲除(miR-155 KO)
7、小鼠和野生型(wild-type,WT)小鼠,并向WT小鼠側(cè)腦室注射pAd-miR-155(pAd作為對照),以過表達(dá)miR-155。采用改良線栓法制備MCAO小鼠模型。ABL處理組MCAO術(shù)前30 min,腹腔注射ABL(20mg/kg)。在BV2小膠質(zhì)細(xì)胞中過表達(dá)或敲低miR-155。腺病毒感染實驗用于在BV2中過表達(dá)miR-155; siRNA轉(zhuǎn)染用于在BV2中敲低miR-155。再分為ABL處理組(100μmol/L)和不用AB
8、L處理組,氧糖剝奪處理24 h。
腦缺血后24 h處死動物進行觀察、檢測。各組取材前進行神經(jīng)功能評分、TTC染色評價梗死體積;應(yīng)用Western blotting和qRT-PCR方法檢測腦組織和細(xì)胞中TNF-α、IL-1β的表達(dá)。
結(jié)果:
1.缺血腦組織和OGD誘導(dǎo)的BV2細(xì)胞中miR-155的表達(dá):qRT-PCR結(jié)果顯示,MCAO后24 h,與sham組相比,腦組織中miR-155的表達(dá)顯著升高(P<0.
9、05),而ABL處理后,miR-155表達(dá)顯著減少,且呈劑量依賴性。BV2小膠質(zhì)細(xì)胞經(jīng)OGD處理4h后miR-155的表達(dá)顯著升高(P<0.05);用ABL預(yù)處理24 h,miR-155的表達(dá)則明顯下降(P<0.05)。
2.神經(jīng)功能評分:MCAO24 h后,與WT組相比,miR-155KO組的神經(jīng)功能評分明顯降低(P<0.05);而ABL處理不再繼續(xù)降低神經(jīng)功能評分(P>0.05)。
3.腦梗死體積:MCAO24
10、h后,與WT組相比,miR-155KO組蒼白色梗死體積明顯縮小(P<0.05);但ABL處理不再使梗死體積進一步減少(P>0.05)。
4.ABL抑制miR-155介導(dǎo)的炎癥反應(yīng):Western blotting結(jié)果顯示,梗死后,miR-155 KO小鼠缺血腦組織中TNF-α和IL-1β的表達(dá)顯著減少(P<0.05);ABL處理進一步減少了miR-155 KO小鼠TNF-α和IL-1β的表達(dá)。在qRT-PCR結(jié)果中,我們觀察到
11、相似的變化。通過向WT小鼠側(cè)腦室注射pAd-miR-155使miR-155過表達(dá)后,則顯著增高缺血腦組織中TNF-α和IL-1β的表達(dá)水平,兩種炎癥因子的上調(diào)可被ABL輕微抑制。qRT-PCR的結(jié)果與蛋白表達(dá)變化相一致。細(xì)胞水平顯示,過表達(dá)miR-155顯著增加OGD誘導(dǎo)的BV2小膠質(zhì)細(xì)胞的TNF-α和IL-1β表達(dá)(P<0.05)。敲低miR-155則明顯減低了TNF-α和IL-1β的水平(P<0.05),并且ABL處理能進一步減少這
12、兩種炎性因子的表達(dá)。
結(jié)論:在缺血腦組織和OGD誘導(dǎo)的BV2細(xì)胞中,miR-155表達(dá)顯著增加,ABL抑制miR-155的表達(dá);miR-155功能獲得和缺失實驗證實,miR-155介導(dǎo)TNF-α和IL-1β的表達(dá);ABL通過抑制miR-155表達(dá)來下調(diào)TNF-α和IL-1β的水平,從而起到抑制炎癥反應(yīng)的作用。
第三部分 旋覆花內(nèi)酯通過抑制miR-155介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)而發(fā)揮腦保護作用
目的:揭示ABL調(diào)制mi
13、R-155表達(dá)及其抗炎作用的分子機制。
方法:選用8周齡雄性miR-155基因敲除(miR-155 KO)小鼠和野生型(wild-type,WT)小鼠,通過向WT小鼠側(cè)腦室注射pAd-miR-155使miR-155過表達(dá)。采用改良線栓法制備MCAO小鼠模型。MCAO前30min,ABL處理組向腹腔注射ABL(20 mg/kg)。在BV2細(xì)胞中過表達(dá)或敲低miR-155,腺病毒感染實驗用于在BV2細(xì)胞中過表達(dá)miR-155,si
14、RNA轉(zhuǎn)染實驗用于敲低miR-155。再分為ABL處理組(100μmol/L)和不用ABL處理組兩組。OGD處理24 h。
腦缺血后24 h處死動物進行觀察、檢測。應(yīng)用Western blotting和qRT-PCR方法檢測腦組織和BV2細(xì)胞中TLR4、MyD88和SOCS1的表達(dá);用Western blotting檢測Akt、ERK、JNK和NF-κB等炎癥信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子的磷酸化水平。
結(jié)果:
1.ABL通
15、過調(diào)制TLR4/MyD88和SOCS1表達(dá)抑制miR-155介導(dǎo)的炎癥反應(yīng):Western blotting結(jié)果顯示,WT小鼠MCAO后24 h,TLR4條帶明顯可見,而TLR4表達(dá)在miR-155 KO小鼠中明顯降低(P<0.05),同時,TLR4表達(dá)在miR-155 KO小鼠中不再因ABL處理而進一步降低。miR-155 KO小鼠中MyD88和SOCS1的表達(dá)顯著高于WT小鼠(P<0.05),ABL處理與否對其表達(dá)無明顯影響。qRT
16、-PCR得到類似的結(jié)果。miR-155過表達(dá)小鼠的缺血腦組織中TLR4的表達(dá)顯著增高(P<0.05);ABL能顯著抑制TLR4的表達(dá)。相反,miR-155過表達(dá)降低MyD88和SOCS1的表達(dá),ABL處理則上調(diào)其表達(dá)。我們進一步用BV2細(xì)胞對整體水平的實驗結(jié)果進行驗證,發(fā)現(xiàn)在OGD處理的BV2細(xì)胞中,miR-155過表達(dá)促進TLR4,抑制MyD88和SOCS1的表達(dá)。敲除miR-155后,TLR4的表達(dá)下調(diào),而MyD88和SOCS1的表
17、達(dá)增加。ABL孵育后,TLR4、MyD88和SOCS1的表達(dá)變化與整體實驗結(jié)果相一致。
2.ABL不直接作用于炎癥信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子:在過表達(dá)miR-155的小鼠,MCAO后缺血腦組織中p-Akt、p-ERK、p-JNK和p-NF-κB水平明顯升高。相反,miR-155敲除則使這些信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子的磷酸化水平降低。說明miR-155參與Akt、ERK、JNK和NF-κB的表達(dá)和/或激活。我們在BV2細(xì)胞水平上進一步證實了整體水平上的實驗
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