阿司匹林通過EphA4通路保護(hù)缺血性腦白質(zhì)損傷的機制研究.pdf

1、腦白質(zhì)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)重要的組成部分，慢性腦缺血誘發(fā)的腦白質(zhì)損傷（WML）可導(dǎo)致患者出現(xiàn)認(rèn)知功能、感覺功能的缺失、肢體功能障礙、精神發(fā)育的異常等，其主要病理改變之一為少突膠質(zhì)細(xì)胞（OLs）的變性死亡、髓鞘的脫失。我們前期實驗發(fā)現(xiàn)，傳統(tǒng)的非甾體類抗炎藥物阿司匹林（ASA）可通過ERK及RhoA信號通路促進(jìn)WML大鼠胼胝體（CC）內(nèi)少突膠質(zhì)前體細(xì)胞（OPC）的增殖、分化與成熟，但其作用機制尚不清楚。已有研究報道，ASA可以抑制前列腺素產(chǎn)生，后

2、者可激活Eph-Ephrin信號通路引發(fā)炎性反應(yīng)，而且Eph-Ephrin是調(diào)控ERK及RhoA的共同上游分子，ERK及RhoA可促進(jìn)少突膠質(zhì)細(xì)胞增殖、分化、成熟及髓鞘形成。那么阿司匹林能否通過抑制Eph-Ephrin信號通路促進(jìn)OPC的增殖、分化與成熟，目前仍未見報道。本課題擬通過實時定量PCR（Real-time PCR）方法在體外培養(yǎng)的OPC和體內(nèi)正常大鼠CC中篩選出表達(dá)水平最高的Eph受體，并以其作為研究對象；進(jìn)一步通過免疫熒光

3、化學(xué)染色法觀察Eph受體在體內(nèi)及體外的OPC、OLs及星形膠質(zhì)細(xì)胞中的定位情況；采用雙側(cè)頸總動脈結(jié)扎（CCAO）建立大鼠WML模型，觀察 ASA對腦白質(zhì)損傷后Eph受體是否受到影響；觀察加入Eph受體抑制劑后OPC的變化情況，最后通過受體配體結(jié)合實驗證實ASA是否直接作用于Eph受體上。預(yù)期研究結(jié)果將為ASA應(yīng)用于WML的防治提供一定的理論依據(jù)。
　　實驗一、Eph受體在大鼠腦白質(zhì)及培養(yǎng)OPC細(xì)胞中表達(dá)的研究
　　目的：

4、r>　　研究不同類型的Eph受體在大鼠胼胝體部及培養(yǎng)的OPC細(xì)胞中表達(dá)水平。
　　方法：
　　在正常大鼠胼胝體部通過Real-time PCR法檢測14種Eph受體的表達(dá)情況；在培養(yǎng)的OPC細(xì)胞上通過Real-time PCR法檢測不同Eph受體的表達(dá)情況。
　　結(jié)果：
　　1）在正常大鼠胼胝體部中，除了EphA10外，其他13種Eph受體（EphA1-8、EphB1-4、EphB6）均有表達(dá)，其中EphA4的m

5、RNA表達(dá)水平最高，其次是EphB6，之后為EphB1、EphA7，表達(dá)水平最低的是EphB4。
　　2）我們進(jìn)一步在培養(yǎng)OPC細(xì)胞中，對上述4種表達(dá)相對較高的Eph受體及EphB4進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)：EphA4的表達(dá)水平仍為最高，其次是EphB1、EphB6、EphA7、EphB4；
　　結(jié)論：
　　大鼠胼胝體和體外培養(yǎng)OPC細(xì)胞中均有不同Eph受體的表達(dá)，其中以EphA4的表達(dá)最高，提示該受體可能作為最主要的分子之一參

6、與Eph-Ephrin信號通路在少突膠質(zhì)細(xì)胞的功能，為我們后續(xù)研究對象的選擇提供了一定的實驗依據(jù)。
　　實驗二、EphA4在腦白質(zhì)中細(xì)胞定位的研究
　　目的：
　　研究EphA4受體在大鼠胼胝體分布、定位情況，并在培養(yǎng)OPC、OLs及星形膠質(zhì)細(xì)胞上進(jìn)行進(jìn)一步驗證。
　　方法：
　　在胼胝體平面，制作大鼠腦冰凍切片，進(jìn)行免疫組織化學(xué)雙標(biāo)記染色，觀察少突膠質(zhì)前體細(xì)胞（OPC）標(biāo)記物NG2、成熟少突膠質(zhì)細(xì)胞（OL

7、s）標(biāo)記物MBP、星形膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物GFAP與EphA4受體共表達(dá)情況；進(jìn)一步對原代培養(yǎng)的OPC、OLs及星形膠質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行NG2、OLs標(biāo)記物CNPase、GFAP與EphA4受體免疫細(xì)胞化學(xué)雙標(biāo)記染色，觀察其共表達(dá)情況。
　　結(jié)果：
　　體內(nèi)實驗證實了EphA4與OPC標(biāo)記物NG2、成熟的少突膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物MBP、星形膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物 GFAP可以共標(biāo)記。體外實驗同樣證實了EphA4與NG2、OLs標(biāo)記物CNPase、GFA

8、P可以共標(biāo)記。同時EphA4在OPC細(xì)胞突起和胞體上均有表達(dá)，且主要表達(dá)在胞體上；EphA4在OLs細(xì)胞樹突和胞體上均有表達(dá)；EphA4均勻表達(dá)在星形膠質(zhì)細(xì)胞突起和胞體上。
　　結(jié)論：
　　EphA4受體表達(dá)在腦白質(zhì)中的OPC、OLs及星形膠質(zhì)細(xì)胞上。
　　實驗三、腦白質(zhì)損傷后阿司匹林對EphA4受體表達(dá)影響的研究
　　目的：
　　研究阿司匹林是否可以影響腦白質(zhì)損傷后 EphA4受體的表達(dá)。
　　方法

9、：
　　采用雙側(cè)頸總動脈結(jié)扎（CCAO）的方法制作大鼠 WML模型，分別選擇低劑量（25mg/kg/d）、高劑量（100mg/kg/d）ASA處理28天后，通過免疫組織化學(xué)雙標(biāo)記染色方法，觀察用藥前后各組大鼠胼胝體部EphA4、OPC標(biāo)記物NG2和OLs標(biāo)記物CNPase陽性細(xì)胞的變化情況。Western blot方法觀察用藥前后EphA4、OPC標(biāo)記物PDGF?R、成熟少突膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物MBP蛋白表達(dá)量的情況。
　　結(jié)果：

10、
　　1）免疫組織化學(xué)雙標(biāo)記染色法顯示：與正常組相比，CCAO組胼胝體部EphA4陽性細(xì)胞數(shù)量明顯增多，具有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.05），同時NG2陽性細(xì)胞數(shù)量也增多，具有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.05）。在施加低劑量ASA（25mg/kg/d）后，與CCAO組相比，ASA組EphA4陽性細(xì)胞數(shù)量減少，具有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.05）；NG2陽性細(xì)胞數(shù)量進(jìn)一步增多，具有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.05）。與正常組相比，CCAO組CNPase陽性細(xì)胞

11、數(shù)量減少，具有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.05）。在施加高劑量ASA后（100mg/kg/d），與CCAO組相比，ASA組 EphA4陽性細(xì)胞數(shù)量同樣減少，具有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.05），但兩組的CNPase陽性細(xì)胞數(shù)量無明顯變化，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P?0.05）；
　　2）通過Western blot方法顯示：與正常組比較，CCAO組大鼠胼胝體部EphA4和PDGF?R表達(dá)均升高，具有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.05）。在低劑量ASA組中，與C

12、CAO組相比較，ASA組EphA4表達(dá)水平下降，具有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.05），PDGF?R表達(dá)水平明顯升高，具有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.05）。與正常組比較，CCAO組大鼠胼胝體部MBP表達(dá)水平降低，具有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.05）。在高劑量ASA組中，與CCAO組相比較，ASA組EphA4表達(dá)水平下降，具有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.05），MBP表達(dá)卻升高，結(jié)果有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.05）；
　　結(jié)論：
　　缺血性腦白質(zhì)損傷后，Ep

13、hA4表達(dá)明顯上調(diào)、OPC細(xì)胞數(shù)量明顯增多，而成熟的OLs細(xì)胞數(shù)量明顯減少。ASA處理后可顯著降低EphA4的表達(dá)，低劑量ASA引起OPC數(shù)量增高，高劑量ASA則未見OLs數(shù)量有明顯改變。
　　實驗四、阿司匹林通過EphA4受體影響OPC增殖的機制研究
　　目的：
　　研究阿司匹林是否通過EphA4受體影響OPC細(xì)胞的增殖，進(jìn)一步探討阿司匹林是否直接作用于EphA4受體。
　　方法：
　　采用原代培養(yǎng)OPC

14、的方法取得純化后的OPC細(xì)胞，選擇低劑量（0.1μM）ASA和250nM EphA4受體抑制劑（EphA4-Fc）處理24小時后，通過NG2免疫細(xì)胞化學(xué)染色方法，觀察各組NG2陽性O(shè)PC細(xì)胞數(shù)量；采用放射性同位素標(biāo)記EphA4受體的經(jīng)典配體EphrinA4，并使之與體外分離的EphA4受體相結(jié)合，再用實驗藥物ASA、前列腺素E2（PGE2）與之競爭結(jié)合受體，觀察ASA、前列腺素E2是否能夠置換出放射性標(biāo)記的配體EphrinA4。通過記錄

15、下的放射性同位素值，計算出結(jié)合率，從而得出阿司匹林是否與EphA4受體相結(jié)合。
　　結(jié)果：
　　1）采用NG2免疫細(xì)胞化學(xué)染色法發(fā)現(xiàn)：與對照相比，EphA4-Fc組OPC的細(xì)胞總數(shù)明顯高于溶劑對照組，具有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.05），施加0.1μM ASA后，OPC的細(xì)胞總數(shù)進(jìn)一步增加，具有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.05）；
　　2）配體受體結(jié)合實驗顯示：EphA4受體的配體EphrinA4（15μM）與EphA4受體結(jié)合率可