microRNA對冠心病疑似致病基因LPPR4表達調(diào)控的初步研究.pdf

1、冠狀動脈性心臟病簡稱冠心病(Coronary Artery Disease，CAD)在全世界范圍造成嚴重的醫(yī)療和經(jīng)濟負擔。男性發(fā)病年齡在55歲之前，女性在65歲之前的CAD稱為早發(fā)冠心病(Early Onset Coronary Artery Disease，EOCAD)，遺傳因素在EOCAD發(fā)病中起到的作用尤為突出。收集了一個呈常染色體顯性遺傳的漢族早發(fā)冠心病家系，前期工作中通過全外顯子組測序定位了LPPR4基因3'UTR區(qū)單堿基缺失

2、突變可能是該家系的致病基因，并發(fā)現(xiàn)該突變導致了LPPR4蛋白表達下調(diào)?？紤]到3'UTR區(qū)轉(zhuǎn)錄后表達調(diào)控與microRNA的關(guān)系，為了探究本家系患者早發(fā)冠心病的病理機制，需首先探明LPPR4基因表達是否通過miRNA進行調(diào)控。通過靶點預測網(wǎng)站檢索發(fā)現(xiàn)候選變異正好位于miR-450a的識別位點中，此外既往文獻報道m(xù)iR-103a及miR-155-5p與冠心病密切相關(guān)，通過miRNA-DNA的靶效關(guān)系分析它們有可能與LPPR43'UTR區(qū)產(chǎn)生

3、作用。
　　研究目的：
　　了解目標3種miRNA與LPPR4基因蛋白表達及生理表型關(guān)系，明確目標miRNA是否與LPPR4基因3'UTR片段發(fā)生相互作用，初探后續(xù)調(diào)控表達相關(guān)機制。
　　研究方法：
　　考慮到miRNA的效應與其在細胞內(nèi)的表達豐度密切相關(guān)，首先行qPCR測定目標3種miRNA在包括血管平滑肌細胞在內(nèi)的兩種細胞系內(nèi)的基線豐度。之后行干預實驗，通過轉(zhuǎn)染miRNA mimics后測定LPPR4蛋白表達

4、量變化，以及行transwell試驗測定細胞遷移變化，證實目標miRNA確與LPPR4表達調(diào)控相關(guān)。隨后建立含有野生/突變型LPPR43'UTR區(qū)突變位點序列的熒光報告基因檢測質(zhì)粒，通過luciferase實驗證明目標miRNA是通過與LPPR4基因3'UTR區(qū)前80位堿基序列結(jié)合而發(fā)揮起調(diào)控作用的。最后利用RNA聚合酶Ⅱ強抑制劑放線菌素D對細胞進行預處理抑制細胞轉(zhuǎn)錄，隨即轉(zhuǎn)染miRNA mimics，在不同時間點裂解細胞，行qPCR測

5、定LPPR4mRNA水平隨時間推移的變化，以確定miRNA與LPPR4基因3'UTR區(qū)結(jié)合后是否通過影響mRNA穩(wěn)定性實現(xiàn)調(diào)控。
　　研究結(jié)果：
　　qPCR結(jié)果顯示三種miRNA中miR-103a相對豐度最高。在miRNA干預實驗中轉(zhuǎn)染了miR-103a及miR-450-5p mimics，行蛋白免疫印跡及transwell試驗示高水平miR-450-5p對LPPR4基因的表達可能起下調(diào)作用，而miR-103a對LPPR4

6、基因的表達可能起上調(diào)作用。雙熒光素酶實驗表明這兩種miRNA與3'UTR區(qū)的確產(chǎn)生了相互作用，后續(xù)mRNA穩(wěn)定性實驗中miR-103a組LPPR4mRNA降解率較對照組出現(xiàn)了下調(diào)，而miR-450-5p組和對照組間未發(fā)現(xiàn)顯著差異。
　　研究結(jié)論：
　　1.高水平miR-103a會上調(diào)LPPR4蛋白表達，并抑制血管平滑肌細胞的遷移;而miR-450-5p則下調(diào)LPPR4蛋白表達，并促進血管平滑肌細胞發(fā)生遷移。
　　2.m