CHN1通過促進(jìn)細(xì)胞侵襲遷移參與宮頸癌和先兆子癇疾病發(fā)生的作用及相關(guān)調(diào)控機(jī)制研究.pdf

1、本文主要從以下幾個(gè)部分展開論述:
　　第一部分 CHN1在宮頸癌中的表達(dá)與機(jī)制的研究
　　背景:宮頸癌是全球第二大婦科惡性腫瘤，同時(shí)也是中國致死率排名第八的癌癥，宮頸癌的浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致患者死亡最重要的原因。上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(Epithelial-Mesenchymal Transition，EMT)是當(dāng)前用以解釋實(shí)體腫瘤轉(zhuǎn)移機(jī)制的一大學(xué)說，EMT和其調(diào)節(jié)因子在腫瘤的生長(zhǎng)、凋亡抵抗、轉(zhuǎn)移等方面產(chǎn)生一定的作用。α-嵌合蛋白(α-c

2、himaerin，CHN1)是一種ras相關(guān)蛋白，在信號(hào)信息調(diào)控和發(fā)育中發(fā)揮著重要的作用。本課題就CHN1在宮頸癌發(fā)生發(fā)展中的機(jī)制展開研究，初步探討了CHN1、EMT以及相關(guān)信號(hào)通路的作用關(guān)系以及所涉及的調(diào)控機(jī)制。
　　目的:探討CHN1的表達(dá)與宮頸癌臨床病理學(xué)的關(guān)系，明確CHN1的差異表達(dá)對(duì)腫瘤在體外、體內(nèi)環(huán)境中生物學(xué)行為的影響，探索CHN1參與腫瘤信號(hào)通路的分子機(jī)制。
　　方法:為驗(yàn)證臨床樣本中CHN1與腫瘤之間的關(guān)系，

3、首先，使用免疫組織化學(xué)技術(shù)對(duì)宮頸癌及其配對(duì)的癌旁組織中CHN1的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)，并同時(shí)對(duì)病理類型和相關(guān)參數(shù)進(jìn)行分析，明確CHN1作為腫瘤標(biāo)志物的臨床意義。然后，在宮頸癌細(xì)胞系中分別轉(zhuǎn)染shRNA干擾質(zhì)粒和全長(zhǎng)cDNA克隆表達(dá)質(zhì)粒，經(jīng)篩選獲得穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株，建立CHN1干擾和高表達(dá)的宮頸癌細(xì)胞株，并同時(shí)對(duì)構(gòu)建成功的細(xì)胞進(jìn)行增殖、侵襲和遷移能力的檢測(cè)。第三，分別從mRNA水平和蛋白水平對(duì)CHN1差異表達(dá)細(xì)胞株中EMT標(biāo)志物的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)。第四，利

4、用裸鼠移植瘤實(shí)驗(yàn)檢測(cè)CHN1的表達(dá)對(duì)裸鼠致瘤性的影響，并用免疫組化的方法對(duì)CHN1相關(guān)蛋白的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè);最后，利用Western Blotting和免疫熒光技術(shù)明確CHN1可能參與的腫瘤信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的分子機(jī)制。
　　結(jié)果:免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示，CHN1表達(dá)于宮頸癌組織，主要定位于癌組織的胞漿區(qū)域;與宮頸癌癌旁組織相比，CHN1在癌組織中的陽性率為85.5％，在癌旁組織中的陽性率為43.4％，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。C

5、HN1的表達(dá)情況與腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(P＜0.05)，與宮頸鱗癌患者的年齡、腫瘤病理分期、分化程度無關(guān)(P＞0.05)。生存曲線單因素分析顯示，CHN1表達(dá)強(qiáng)陽性/陽性的宮頸癌患者，其生存時(shí)間低于CHN1陰性的患者，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。體外CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，高表達(dá)CHN1時(shí)，細(xì)胞增殖速度明顯加快，而CHN1的表達(dá)被干擾后，細(xì)胞的增殖能力明顯減弱，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01);克隆形成結(jié)果顯示，高表達(dá)CHN1時(shí)

6、，細(xì)胞克隆形成能力顯著提高，而干擾CHN1表達(dá)時(shí)，宮頸癌細(xì)胞的克隆形成能力明顯減弱，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。侵襲和遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，當(dāng)干擾宮頸癌SiHa細(xì)胞CHN1表達(dá)時(shí)，宮頸癌細(xì)胞的侵襲和遷移能力受到明顯的抑制作用，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。在裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)中，利用CHN1高表達(dá)細(xì)胞株和CHN1干擾細(xì)胞株成功構(gòu)建了裸鼠移植瘤，經(jīng)H&E檢測(cè)其為腫瘤，且CHN1高表達(dá)細(xì)胞株所形成的腫瘤體積更大，經(jīng)免疫組化驗(yàn)證，該腫瘤中

7、CHN1的表達(dá)量更高。Western Blotting結(jié)果顯示，高表達(dá)CHN1可以誘導(dǎo)宮頸癌細(xì)胞發(fā)生EMT，同時(shí)伴隨上皮來源標(biāo)志物表達(dá)的降低，以及間質(zhì)來源標(biāo)志物表達(dá)的提高，并誘導(dǎo)EMT相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)。在宮頸癌細(xì)胞系中，高表達(dá)CHN1可以激活A(yù)kt/GSK-3β信號(hào)通路，而使用該信號(hào)通路特異性抑制劑LY294002時(shí)，該通路的活化受到抑制。
　　結(jié)論:在宮頸癌中CHN1的高表達(dá)與宮頸癌的遠(yuǎn)期預(yù)后不良相關(guān)。CHN1能夠在細(xì)胞水平促

8、進(jìn)腫瘤生物學(xué)行為的發(fā)生。CHN1可以通過對(duì)Akt/GSK-3β對(duì)EMT產(chǎn)生激活作用，并通過EMT促進(jìn)宮頸癌的轉(zhuǎn)移。
　　第二部分 miR-205/CHN1在先兆子癇胎盤中的表達(dá)與作用機(jī)制研究
　　背景:先兆子癇(Preeclampsia，PE)是一種妊娠20周后出現(xiàn)的特發(fā)性高血壓綜合征，是導(dǎo)致孕婦前出血、流產(chǎn)、早產(chǎn)以及胎兒和孕產(chǎn)婦死亡的主要原因之一。微小RNA(microRNAs，miRNAs)是一類內(nèi)源性非編碼小RNA，m

9、iRNAs可以通過基因轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)機(jī)制參與調(diào)控細(xì)胞的增殖、周期調(diào)控、細(xì)胞分化及凋亡等一系列過程。microRNA-205(miR-205)是新近發(fā)現(xiàn)高表達(dá)于先兆子癇患者胎盤和血漿中的miRNA，其參與調(diào)節(jié)先兆子癇的具體機(jī)制尚不清楚。在本研究中，我們證實(shí)miR-205可以靶向調(diào)控CHN1的表達(dá)，而在第一部分的研究中CHN1已被證明可以調(diào)控細(xì)胞的侵襲遷移，所以，我們著重在臨床胎盤樣本和細(xì)胞系中對(duì)miR-205及其靶基因的表達(dá)以及二者間的直接靶

10、向調(diào)控關(guān)系進(jìn)行了檢測(cè)，初步對(duì)miR-205靶向CHN1調(diào)節(jié)絨毛滋養(yǎng)層細(xì)胞的生物學(xué)功能的影響進(jìn)行了探索。
　　目的:在臨床樣本和絨毛滋養(yǎng)層細(xì)胞水平上研究miR-205對(duì)先兆子癇的具體作用機(jī)制，以及miR-205對(duì)CHN1的靶向調(diào)控作用。探索miR-205/CHN1對(duì)滋養(yǎng)層細(xì)胞功能的影響，以及參與調(diào)節(jié)先兆子癇發(fā)生的具體機(jī)制。
　　方法:利用real-time PCR技術(shù)以及免疫組織化學(xué)手段檢測(cè)miR-205以及CHN1在先兆子癇

11、樣本中的表達(dá)情況;生物信息學(xué)預(yù)測(cè)miR-205與CHN1的可能結(jié)合位點(diǎn);構(gòu)建雙熒光素酶報(bào)告載體，利用雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)檢測(cè)miR-205對(duì)其靶基因CHN1-3'UTR區(qū)域的靶向結(jié)合作用;real-time PCR和Western Blotting方法進(jìn)一步驗(yàn)證miR-205與CHN1之間的直接靶向作用;利用CCK-8、transwell、劃痕實(shí)驗(yàn)研究miR-205以及miR-205與其靶基因的相互作用對(duì)絨毛滋養(yǎng)層細(xì)胞生物學(xué)功能的影響。<

12、br>　　結(jié)果:real-time PCR檢測(cè)miR-205和CHN1在正常胎盤和先兆子癇臨床標(biāo)本中的表達(dá)，結(jié)果表明miR-205在先兆子癇樣本中的表達(dá)量顯著高于正常對(duì)照組，而CHN1在先兆子癇患者組中的相對(duì)表達(dá)量則明顯低于正常對(duì)照組，結(jié)果均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);先兆子癇患者和正常產(chǎn)婦胎盤石蠟切片的免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，CHN1在先兆子癇患者的胎盤中低表達(dá)。根據(jù)生物信息學(xué)的預(yù)測(cè)，CHN1-3'UTR區(qū)域有兩個(gè)miR-205的

13、保守性結(jié)合位點(diǎn)，利用pmirGLO-Vector成功構(gòu)建CHN1-3'UTR的野生型和突變型載體后，雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)檢測(cè)miR-205和CHN1的直接靶向結(jié)合情況，結(jié)果顯示，miR-205僅和CHN1的第一個(gè)結(jié)合位點(diǎn)具有靶向結(jié)合效應(yīng)。real-time PCR對(duì)使用模擬物和抑制物處理后的滋養(yǎng)層細(xì)胞中CHN1的表達(dá)檢測(cè)結(jié)果顯示，miR-205對(duì)CHN1的表達(dá)具有負(fù)調(diào)控的作用;Western Blotting檢測(cè)同樣證實(shí)，當(dāng)高表達(dá)miR-

14、205時(shí)，CHN1的表達(dá)明顯下調(diào)。體外增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，絨毛滋養(yǎng)層細(xì)胞高表達(dá)miR-205時(shí)，細(xì)胞的增殖能力顯著減弱;侵襲、遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，miR-205高表達(dá)的絨毛滋養(yǎng)層細(xì)胞具有相對(duì)減弱的侵襲、遷移能力，而同時(shí)轉(zhuǎn)染CHN1可以逆轉(zhuǎn)侵襲能力減弱這一結(jié)果。
　　結(jié)論:與正常組相比，miR-205在先兆子癇患者的胎盤組織中高表達(dá)。miR-205和CHN1-3'UTR區(qū)域結(jié)合，對(duì)CHN1在mRNA和蛋白水平上的表達(dá)具有靶向調(diào)節(jié)作用。m