刺槐素磺酸化代謝處置的機(jī)制研究.pdf

1、目的：
　　刺槐素是一種分布廣泛的黃酮類物質(zhì)，具有抗氧化，抗炎及抗房顫等藥理作用，對(duì)乳腺癌，胃癌及前列腺癌等具有一定的治療作用。然而，大多數(shù)黃酮可發(fā)生廣泛的UGT(UDP-glucuronosyltransferases)和SULT(sulfotransferase)代謝，極大影響其體內(nèi)生物利用度和藥效作用。刺槐素在體外具有良好藥效，但是尚未完全闡明的代謝處置機(jī)制嚴(yán)重制約其成藥性，因此，深入的代謝機(jī)制研究，對(duì)黃酮類藥物的藥效機(jī)制和

2、開發(fā)具有重要意義。
　　本實(shí)驗(yàn)室已對(duì)刺槐素UGT代謝進(jìn)行廣泛地研究，而刺槐素SULT代謝的相關(guān)研究卻鮮有報(bào)道。研究證實(shí)許多黃酮的結(jié)合物是外排蛋白的底物。大量證據(jù)表明藥物代謝酶與外排蛋白對(duì)黃酮的體內(nèi)處置具有協(xié)同作用。然而，刺槐素SULT代謝處置是否由SULT酶或者外排蛋白，還是兩者共同參與仍不清楚。因此，闡明刺槐素SULT代謝處置過程將有助于認(rèn)知其體內(nèi)顯效機(jī)制。
　　因此，采用體內(nèi)與體外模型聯(lián)合的策略首次系統(tǒng)地研究刺槐素SUL

3、T代謝處置機(jī)制。首先建立一個(gè)靈敏可靠的UHPLC-MS/MS方法對(duì)刺槐素及其SULT代謝物同時(shí)定量。運(yùn)用此方法，通過刺槐素SULT代謝體外孵育實(shí)驗(yàn)，考察其體外的SULT代謝特點(diǎn)。外排蛋白基因敲除小鼠的藥動(dòng)學(xué)來研究BCRP、MRP1和MRP2對(duì)刺槐素SULT代謝物的轉(zhuǎn)運(yùn)作用。Caco-2細(xì)胞模型結(jié)合相對(duì)選擇性抑制劑用以模擬刺槐素在腸道的吸收代謝和確證外排蛋白對(duì)刺槐素SULT代謝物的轉(zhuǎn)運(yùn)作用。
　　方法：
　　1.刺槐素7位磺酸

4、化物的鑒定及質(zhì)譜定量方法的建立
　　利用Agilent UHPLC-DAD-QTOF MS鑒定刺槐素的SULT代謝產(chǎn)物，同時(shí)建立檢測(cè)刺槐素及其SULT代謝物的質(zhì)譜MRM方法。
　　2.刺槐素的體外SULT代謝機(jī)理
　　采用5種雄性種屬（人，猴，大鼠，小鼠和犬）肝臟組織S9和5種人源化SULT（1A1，181，1E1，2A1和281）亞酶分別研究刺槐素在不同種屬及亞酶的SULT代謝特點(diǎn)。
　　3.刺槐素在小鼠體內(nèi)的

5、生物利用度及藥代動(dòng)力學(xué)
　　口服或尾靜脈給藥野生型FVB，Bcrp-/-，Mrp1-/-和Mrp2-/-小鼠，在預(yù)定時(shí)間點(diǎn)收集樣品，并測(cè)量血藥濃度，用WinNonlin(@)3.3非房室模型計(jì)算藥動(dòng)學(xué)參數(shù)。
　　4.刺槐素在小鼠肝臟，小腸及結(jié)腸組織S9介導(dǎo)的酶代動(dòng)力學(xué)
　　采用野生型FVB，Bcrp-/-，Mrp1-/-和Mrp2-/-小鼠肝臟，小腸及結(jié)腸組織S9分別考察刺槐素的SULT代謝的酶動(dòng)學(xué)特征。
　　5

6、.外排轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白對(duì)刺槐素SULT代謝物的轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制
　　采用Caco-2細(xì)胞模型結(jié)合相對(duì)選擇性的外排蛋白抑制劑（BCRP抑制劑Ko143，MRP2和MRP1抑制劑MK571）來研究MRP1，MRP2以及BCRP對(duì)Aca-7-S的轉(zhuǎn)運(yùn)作用。
　　結(jié)果：
　　1.刺槐素7位磺酸化代謝物的鑒定
　　刺槐素的磺酸化結(jié)合的位置為7位羥基，對(duì)應(yīng)的代謝產(chǎn)物為刺槐素7位磺酸化代謝物(Aca-7-S)。
　　2.刺槐素體外SUL

7、T代謝具有明顯的種屬及亞型差異性
　　Aca-7-S是刺槐素SULT代謝體外孵育的主要暴露形式。SULT1A1是介導(dǎo)刺槐素SULT代謝的主要亞型。不同SULT酶的磺酸化催化速率順序:SULT1A1＞SULT1E1＞SULT1B1＞SULT2A1＞SULT281。犬對(duì)刺槐素SULT代謝具有最快的代謝速率。不同種屬的磺酸化催化速率順序:犬＞大鼠＞人＞猴＞小鼠。
　　3.刺槐素在小鼠體內(nèi)的生物利用度及藥代動(dòng)力學(xué)
　　刺槐素在

8、野生型FVB小鼠體內(nèi)的生物利用度為7.4％，表明刺槐素的體內(nèi)生物利用度較低。Aca-7-S是刺槐素體內(nèi)SULT代謝的主要暴露形式。Aca-7-S在Bcrp-/-小鼠的AUC0-∞顯著高于野生型FVB小鼠(p＜0.05)，而Mrp1-/-小鼠的AUC0-∞則顯著低于野生型FVB小鼠(p＜0.05)。說明MRP1與BCRP參與Aca-7-S的外排;MRP2未參與Aca-7-S的轉(zhuǎn)運(yùn)。
　　4.刺槐素在小鼠肝臟，小腸及結(jié)腸組織S9介導(dǎo)的

9、酶代動(dòng)力學(xué)
　　Mrp1-/-和Bcrp-/-小鼠的小腸組織S9對(duì)刺槐素SULT代謝的酶動(dòng)學(xué)特征為米氏方程模型;四種小鼠的其他組織S9對(duì)刺槐素SULT代謝的酶動(dòng)學(xué)特征均為底物抑制模型。說明四種小鼠的肝臟和結(jié)腸組織S9對(duì)刺槐素SULT代謝的代謝特征相同。
　　5.BCRP和MRP1對(duì)刺槐素7位磺酸化物的轉(zhuǎn)運(yùn)作用
　　MRP1抑制劑MK571和BCRP抑制劑Ko143可分別顯著降低Aca-7-S在BL面和AP面的外排率及清

10、除率;顯著提高胞內(nèi)Aca-7-S的含量(p＜0.05)，表明MRP1與BCRP可能負(fù)責(zé)Aca-7-S的外排;MRP2可能未參與Aca-7-S的轉(zhuǎn)運(yùn)。此結(jié)果與藥動(dòng)學(xué)結(jié)果相符，進(jìn)一步確認(rèn)MRP1與BCRP對(duì)Aca-7-S的外排作用。
　　結(jié)論：
　　刺槐素的SULT代謝主要由SULT1A1介導(dǎo)，Aca-7-S是刺槐素SULT代謝的主要暴露形式，BCRP和MRP1主要參與Aca-7-S的外排。刺槐素的SULT代謝具有明顯的種屬及亞