磺酸基轉(zhuǎn)移酶在肝細(xì)胞癌中的變化及其對(duì)藥物代謝處置的影響.pdf

1、背景和目標(biāo):
　　肝細(xì)胞癌（Hepatocellular carcinoma，HCC）是臨床上最常見的高致死率，高發(fā)性惡性腫瘤。研究由HBV誘發(fā)的肝細(xì)胞癌中肝藥酶的基因和功能性的改變，從中掌握其變化規(guī)律，可為肝癌治療的合理用藥以及肝癌的早期診斷提供幫助。
　　磺酸基轉(zhuǎn)移酶(Sulfotransferases:SULT)，作為肝臟中主要的二相藥物代謝酶，涉及了易誘發(fā)癌癥物質(zhì)的激活和滅活過程。HCC狀態(tài)下SULTs酶活性和表達(dá)的

2、改變會(huì)導(dǎo)致難以預(yù)測藥物對(duì)腫瘤的療效及其對(duì)周圍組織的毒副作用。
　　本研究擬檢測HCC腫瘤組織中SULTs酶活性、蛋白含量及mRNA表達(dá)水平的改變及其相關(guān)性，以白藜蘆醇為例探討HCC患者中SULTs酶活性改變對(duì)藥物代謝的影響，為臨床合理用藥提供參考。
　　方法:
　　1:非同位素標(biāo)記液相與質(zhì)譜聯(lián)用方法(Isotope Label-free UHPLC-MS/MS)和蛋白免疫印跡方法(Western-blot)定量正常人肝

3、組織S9（肝勻漿液的去線粒體上清液，包含了大量藥物代謝酶）中5種SULTs酶的蛋白表達(dá)。
　　2:①差速離心法制備癌旁及HCC腫瘤組織S9蛋白。LC-MS/MS方法絕對(duì)定量5種SULTs酶在癌旁及HCC腫瘤組織S9中的蛋白含量。②底物探針方法評(píng)價(jià)SULTs酶活性。③采用Real-Time PCR方法研究SULTs酶mRNA表達(dá)水平。
　　結(jié)果:
　　1.相比較Western-blot，LC-MS/MS分析方法有更好的專

4、屬性和敏捷性
　　為了驗(yàn)證分析方法的專屬性，分別運(yùn)用LC-MS/MS和Western-blot方法同時(shí)分析人源重組化SULTs蛋白。結(jié)果顯示，Western-blot中只有40％抗體具有專屬性且整個(gè)實(shí)驗(yàn)耗時(shí)達(dá)24小時(shí)以上，而LC-MS/MS方法專屬性達(dá)到100％,耗時(shí)僅6個(gè)小時(shí)且完成一次樣品分析時(shí)間不超過10分鐘。
　　2.在正常人肝組織S9中，SULTs酶蛋白定量和相關(guān)性分析
　　分別運(yùn)用LC-MS/MS和Weste

5、rn-blot方法定量正常人肝組織S9中的5種SULTs酶蛋白表達(dá)。相關(guān)性分析顯示，除了SULT1A3(r2=0.492)和SULT2A1(r2=0.546)，其他SULTs酶（SULT1A1、SULT1B1和SULT1E1）相關(guān)性都良好（r2＞0.6，分別為0.899、0.764和0.691，P＜0.05）。
　　3.HCC腫瘤組織中SULTs酶蛋白含量變化
　　用建立的LC-MS/MS方法首次絕對(duì)定量上述5種SULTs酶

6、在正常人肝組織、癌旁和HCC腫瘤組織中的蛋白含量。結(jié)果顯示，SULT1A1在70％腫瘤組織中的蛋白含量顯著降低，SULT1B1在20％腫瘤組織中的蛋白含量顯著降低，SULT1A3在50％腫瘤組織中的蛋白含量顯著降低，SULT1E1在40％腫瘤組織中的蛋白含量顯著降低，SULT2A1在70％腫瘤組織中的蛋白含量顯著降低。并且，SULTs酶的蛋白含量具有很強(qiáng)的個(gè)體差異性。
　　4.HCC腫瘤組織中SULTs酶活性及其對(duì)白藜蘆醇代謝處置

7、變化
　　運(yùn)用底物探針方法系統(tǒng)地評(píng)價(jià)SULTs酶在混合的正常人肝組織S9、癌旁和HCC腫瘤組織S9中的代謝活性。結(jié)果顯示，HCC腫瘤組織S9中上述5種SULTs酶大部分對(duì)探針底物的代謝速率均顯著降低（SULT1A3和SULT1B1除外）。另外，SULTs酶在腫瘤組織S9中的催化能力(TONs)均與正常和癌旁組織S9無顯著性差異（SULT1A1除外）。個(gè)體研究顯示，SULT1A1在100％腫瘤組織S9中的酶活性顯著降低，SULT1B

8、1在20％腫瘤組織S9中的酶活性顯著降低，SULT1A3在30％腫瘤組織S9中的酶活性顯著降低，SULT1E1在50％腫瘤組織S9中的酶活性顯著降低，SULT2A1在80％腫瘤組織S9中的酶活性顯著降低。
　　另外，在HCC腫瘤組織S9中白藜蘆醇的滅活速率會(huì)顯著性降低。個(gè)體研究顯示，在個(gè)別HCC腫瘤組織S9中白藜蘆醇磺酸化代謝產(chǎn)物的生成速率遠(yuǎn)大于正常和癌旁組織S9。
　　5.HCC腫瘤組織中SULTs酶mRNA表達(dá)水平變化<

9、br>　　相比較于癌旁組織，SULTs酶mRNA表達(dá)水平在90％以上腫瘤組織樣品中顯著下調(diào)90％以上（SULT1B1除外），并且個(gè)體差異的現(xiàn)象尤為突出。
　　6.SULTs酶蛋白含量與代謝活性的變化及其對(duì)白藜蘆醇代謝處置的相關(guān)性
　　結(jié)果顯示，癌旁和HCC腫瘤組織S9中SULTs酶活性與其蛋白含量具有較強(qiáng)相關(guān)性(r2＞0.6，SULT1A3除外)，而與mRNA表達(dá)水平相關(guān)性較弱。
　　白藜蘆醇在體內(nèi)的代謝由SULTs酶

10、的參與。相比較于癌旁組織，白藜蘆醇在HCC腫瘤組織S9中的代謝速率與SULT1A1的酶活性及蛋白含量相關(guān)性更加顯著(r2＞0.6)。
　　結(jié)論:
　　SULTs酶蛋白含量下調(diào)會(huì)引起HCC腫瘤組織S9中SULTs酶活性顯著降低，而酶蛋白分子催化能力并未顯著改變。同時(shí)，本研究建立了一種快速、靈敏和準(zhǔn)確的LC-MS/MS方法可同時(shí)測定正常人肝組織S9，癌旁和HCC腫瘤組織S9中SULTs酶蛋白絕對(duì)含量;并以白藜蘆醇為例探討HCC患