COMT在木犀草素處置中的作用及甲基化代謝區(qū)域選擇性研究.pdf

1、兒茶酚氧位甲基轉(zhuǎn)移酶(Catechol-O-methyltransferase，COMT；EC2.1.1.6)在體內(nèi)代謝多種兒茶酚類神經(jīng)遞質(zhì)和激素(如多巴胺、腎上腺素、去甲腎上腺素、2-羥基雌二醇、4-羥基雌二醇等)。自1958年首次報道COMT參與代謝多巴胺以來，COMT在神經(jīng)學科和精神學科中受到廣泛關(guān)注，研究結(jié)果顯示COMT在精神功能方面具有重要的調(diào)節(jié)作用。COMT抑制劑可以有效增加左旋多巴的體內(nèi)暴露量從而輔助治療帕金森病，因此，尋

2、找新型COMT抑制劑一直是帕金森病研究中一個熱點。在藥物代謝領域，COMT屬于一個二相藥物代謝酶，將一個甲基基團從甲基供體(S-腺苷甲硫氨酸，英文：S-adenosyl-L-methionine，縮寫：SAM)轉(zhuǎn)移到底物的鄰二酚羥基上，該甲基化代謝對底物的藥物代謝動力學和藥效學將產(chǎn)生較大的影響。
　　 黃酮化合物是自然界中分布最為廣泛的植物多酚，研究顯示其具有多種藥理活性，如抗腫瘤、抗氧化、抗炎等，流行病學研究提示，飲食中黃酮的

3、攝入量與癌風險的降低存在一定的相關(guān)性。目前，一些黃酮化合物或含有黃酮的植物提取物被廣泛應用到臨床藥物和功能食品開發(fā)中。由于黃酮的酚羥基結(jié)構(gòu)，一般認為其在體內(nèi)主要發(fā)生二相代謝，包括葡醛酸轉(zhuǎn)移酶(UDP-glucuronosyltransferases，UGTs)和硫酸酯轉(zhuǎn)移酶(Sulfotransferases，SULTs)介導的結(jié)合反應。一些黃酮分子結(jié)構(gòu)中存在鄰二酚羥基結(jié)構(gòu)，其可以被COMT識別發(fā)生甲基化代謝，而甲基化后的黃酮仍具有藥理

4、活性，因此，研究COMT介導的鄰二酚羥基黃酮的甲基化代謝，有助于闡明該類黃酮的體內(nèi)過程及作用機制。本文主要研究COMT介導的菊花主要的有效成分之一--木犀草素(3’，4’，5，7-tetrahydroxyflavone，luteolin)的體內(nèi)外甲基化代謝，以及甲基化代謝在木犀草素處置中的作用。
　　 第一章大鼠口服菊花提取物后木犀草素和芹菜素藥動學差異研究
　　 背景和目的：前期研究大鼠口服菊花提取物(Chrysant

5、hemum morifoliumextract，CME)后的藥動學發(fā)現(xiàn)，雖然木犀草素和芹菜素(4’，5，7-trihydroxyflavone，apigenin)分子結(jié)構(gòu)相似(后者B環(huán)中少一個羥基)，且兩者在CME中含量接近，但是當大鼠口服CME后，血漿中木犀草素濃度顯著低于芹菜素，木犀草素AUC0-t約為芹菜素的10％。根據(jù)文獻報道及課題組原有研究結(jié)果(微粒體代謝、腸道水解、大鼠組織分布和排泄等)均不能解釋兩者巨大的血漿暴露量差異。本

6、章主要從吸收和代謝兩方面研究探討木犀草素暴露量顯著低于芹菜素的可能機制。
　　 方法：大鼠空腸單向灌流模型和絕對生物利用度模型評價大鼠腸道對木犀草素和芹菜素的吸收差異；大鼠肝微粒體-相代謝體系、大鼠肝、腎、肺、小腸組織S9孵育體系、大鼠原代肝細胞模型評價木犀草素和芹菜素的代謝穩(wěn)定性差異。
　　 結(jié)果：大鼠空腸單向灌流結(jié)果顯示，木犀草素的腸道通透性參數(shù)(ka，7.96 min-1和Peff，4.87 cm/min)僅為芹菜

7、素(ka，18.5 min-1和Peff，10.8 cm/min)的50%左右；大鼠口服CME后，木犀草素的絕對生物利用度(30.4%)顯著低于芹菜素(51.1%)。大鼠肝微粒體一相代謝體系中，芹菜素代謝消除顯著快于木犀草素，而大鼠組織S9和原代肝細胞代謝模型上，木犀草素代謝消除顯著快于芹菜素，且在水解后的木犀草素孵育樣品中檢測到一個未知甲基化代謝產(chǎn)物M。
　　 結(jié)論：腸道吸收和各組織代謝是大鼠口服CME后，造成木犀草素血漿暴露

8、量顯著低于芹菜素的兩個重要原因，木犀草素的未知甲基化代謝M可能與木犀草素在大鼠體內(nèi)快速消除密切相關(guān)。
　　 第二章大鼠COMT介導的木犀草素甲基化代謝研究
　　 背景和目的：推測木犀草素的未知甲基化代謝M可能與木犀草素在大鼠體內(nèi)快速消除有關(guān)，因此有必要深入研究該代謝物結(jié)構(gòu)及其代謝途徑。因此，本章首先鑒定甲基化代謝物結(jié)構(gòu)及介導其甲基化代謝的酶，并評價該代謝酶在木犀草素體內(nèi)處置中的作用。
　　 方法：1)代謝物鑒定：

9、大鼠靜脈給予6.5 mg/kg木犀草素前后，分別收集尿液，樣品經(jīng)水解處理后，HPLC分析，尋找代謝產(chǎn)峰，并與代謝物對照品比對紫外光譜(200-400 nm)、色譜、質(zhì)譜信息及查閱相關(guān)文獻，確定代謝物結(jié)構(gòu)。2)根據(jù)木犀草素含鄰二酚羥基的結(jié)構(gòu)特征，推測該甲基化代謝由COMT介導，因此，考察在有或無COMT特異性抑制劑恩他卡朋時甲基化產(chǎn)物量的變化，以闡明COMT的作用。3)考察大鼠不同組織(肝、腎、小腸、肺和紅細胞)中兩個甲基化代謝物生成酶動

10、力學，探討大鼠COMT對木犀草素甲基化代謝的區(qū)域選擇性。4)考察給與不給恩他卡朋時大鼠靜脈注射木犀草素后，木犀草素及甲基化代謝物血漿藥動學和尿液排泄的變化，以闡明COMT在木犀草素體內(nèi)處置中的作用。
　　 結(jié)果：1)大鼠靜脈注射木犀草素后，在其尿液中發(fā)現(xiàn)間位(meta)甲基化木犀草素(金圣草素)和對位(para)甲基化木犀草素(香葉木素)；2)COMT抑制劑恩他卡朋顯著抑制木犀草素在大鼠組織中的甲基化代謝；3)酶動力學研究結(jié)果顯

11、示，甲基化產(chǎn)物金圣草素和香葉木素的生成動力學均符合Michaelis-Menten方程，兩者的km接近(3.57～3.82μM)，但是金圣草素的Vmax僅為香葉木素二分之一；4)思他卡朋可以顯著提高大鼠血漿和尿液中木犀草素草素的濃度，降低血漿和尿液中甲基化代謝物的生成。
　　 結(jié)論：木犀草素經(jīng)大鼠COMT代謝生成meta甲基化木犀草素(金圣草素)和para甲基化木犀草素(香葉木素)；木犀草素B環(huán)上para-OH是COMT甲基化代

12、謝的優(yōu)勢部位；COMT介導的甲基化代謝是木犀草素大鼠體內(nèi)重要的代謝途徑。
　　 第三章COMT在大鼠口服菊花提取物藥動學中的作用
　　 背景和目的：研究證明COMT介導的甲基化代謝對木犀草素體內(nèi)處置具有重要作用，我們推測COMT是大鼠口服菊花提取物(CME)后造成木犀草素暴露量低于芹菜素的重要原因。另外，兩個甲基化代謝物(金圣草素和香葉木素)仍具有生理活性，因此，有必要在CME藥動學研究中同時檢測木犀草素的兩個甲基化產(chǎn)物

13、。本章首先建立大鼠血漿中同時測定木犀草、芹菜素、金圣草素和香葉木素的HPLC分析方法，然后應用該方法考察大鼠口服CME后木犀草素及其甲基化代謝物(金圣草素和香葉木素)的藥動學及COMT抑制劑恩他卡朋對其的影響。
　　 方法：色譜分柱：Agilent Zorbax SB-C18 column(250 mm×3.6 mm，5μm)；流動相：0.1%甲酸/乙腈/甲醇=(60/16/24，v/v/v)；內(nèi)標：槲皮素。按照臨床前藥動學研究

14、規(guī)范要求，進行方法學驗證，包括方法的專屬性、線性、范圍、定量下限、精密度、準確度和樣品穩(wěn)定性。該方法應用于大鼠口服100 mg/kg CME及(100mg/kg CME+20 mg/kg恩他卡朋)后四個黃酮的血漿藥動學研究。
　　 結(jié)果：在本色譜條件下，四個待測成分均能基線分離，血漿中內(nèi)源性物質(zhì)不干擾測定；在0.025-10μg/mL范圍內(nèi)線性良好；定量下限均為0.025μg/mL；四個待測物提取回收率76.94-96.7%，方

15、法回收率104.4-93.2%，批內(nèi)和批間精密度均<7.0%，-80℃條件下7天內(nèi)穩(wěn)定(>90%)。大鼠口服CME后，血漿中檢測到芹菜素、木犀草素、金圣草素和香葉木素，在同時給予恩他卡朋后，金圣草素和香葉木素血漿濃度顯著降低，而木犀草素濃度顯著增加。
　　 結(jié)論：COMT在大鼠口服CME后的木犀草素體內(nèi)處置中發(fā)揮一定的作用。
　　 第四章人COMT大腸桿菌表達系統(tǒng)構(gòu)建
　　 背景與目的：為深入研究人源COMT對含

16、鄰二酚羥基黃酮(如木犀草素)的甲基化代謝。本章主要構(gòu)建人COMT大腸桿菌表達系統(tǒng)(包括野生型和108V/M突變型)，為后續(xù)研究提供代謝模型。
　　 方法：1)構(gòu)建pET-28a(+)-hCOMT*1(108V)和pET-28a(+)-hCOMT108*2(108M)表達質(zhì)粒，利用pET-28a(+)上的組氨酸標簽，形成COMT-his tag融合蛋白；2)利用E.coli Rosseta(DE3)菌株表達COMT蛋白；3)SDS

17、-page、western blot驗證目的蛋白表達；4)利用親和純化技術(shù)獲得目的蛋白；5)用經(jīng)典COMT底物槲皮素鑒定蛋白活性及比較hCOMT*1和hCOMT*2熱穩(wěn)定性差異。
　　 結(jié)果：成功構(gòu)建了pET-28a(+)-hCOMT*1(108V)和pET-28a(+)-hCOMT108*2(108M)表達質(zhì)粒，并在E.coli Rosseta(DE3)菌株中表達COMT蛋白。經(jīng)過親和純化后，獲得較高純度(65%以上)的hCO

18、MT*1和hCOMT*2蛋白，驗證其均具有甲基化代謝活性，且hCOMT*2顯示出顯著的熱不穩(wěn)定性。
　　 結(jié)論：本研究成功構(gòu)建了人COMT大腸桿菌表達系統(tǒng)，制備的hCOMT*1和hCOMT*2蛋白均可以作為后期人COMT代謝研究的酶源。
　　 第五章木犀草素人體內(nèi)外甲基化代謝研究
　　 背景與目的：COMT識別底物的鄰二酚羥基結(jié)構(gòu)，只能將底物中的一個酚羥基甲基化，因此存在meta和para羥基間區(qū)域選擇性。文獻報

19、道COMT底物均傾向發(fā)生meta位甲基化，而本課題研究發(fā)現(xiàn)，木犀草素在大鼠組織勻漿甲基化代謝中均優(yōu)先發(fā)生para甲基化。為闡明人COMT介導的木犀草素甲基化是否具有同樣的區(qū)域選擇性，考察人COMT對木犀草素甲基化代謝的區(qū)域選擇性。文獻報道，體內(nèi)甲基化產(chǎn)物的相對量與體外代謝的區(qū)域選擇性存在不一致的現(xiàn)象，但機制尚不清楚，本研究以木犀草素為研究對象，在人體模型中進行機制研究。
　　 方法：1)利用重組人COMT模型，考察木犀草素甲基化

20、代謝酶動力學，計算酶學參數(shù)，分析meta與para羥基間甲基化的區(qū)域選擇性；2)健康志愿者3人，口服12顆脈舒膠囊(相當1 mg/kg木犀草素)前后，收集尿液，樣品水解后，HPLC測定其中金圣草素和(meta甲基化)和香葉木素(para甲基化)濃度并計算meta/para甲基化產(chǎn)物相對量；3)人肝微粒體模型和重組人CYP1A2和CYP3A4/5模型研究進一步代謝金圣草素和香葉木素的酶及其代謝特征。
　　 結(jié)果：1)酶動力學參數(shù)分

21、別為：金圣草素和香葉木素的Vmax(pmolmg protein-1min'1)分別為：2735±313和4972±558.2，Km(μM)分布為：1.889±0.5994和2.178±0.5898，以CLint(Vmax/Km)計算金圣草素/香葉木素比值為0.62；2)人口服含木犀草素制劑后，尿液中能檢測到金圣草素和香葉木素，且金圣草素/香葉木素的濃度比值為1.98±0.5，即存在人體內(nèi)外木犀草素甲基化代謝產(chǎn)物相對量不一致的現(xiàn)象；3)

22、人肝微粒體及重組酶模型顯示，CYP1A2和CYP3A4/5參與催化金圣草素和香葉木素進一步的脫甲基化代謝，且香葉木素較金圣草素更容易發(fā)生脫甲基代謝生成木犀草素。
　　 結(jié)論：1)木犀草素在人COMT酶動力學研究顯示，木犀草素優(yōu)先發(fā)生para甲基化(meta/para：0.62)，與大鼠組織勻漿中木犀草素的甲基化區(qū)域選擇性一致；2)人體內(nèi)外存在木犀草素甲基化代謝產(chǎn)物相對量不一致的現(xiàn)象，而CYP1A2和CYP3A4/5對para甲基