TRPC3通道調(diào)控血管平滑肌線粒體功能在高血壓中的作用及機(jī)制.pdf

1、背景和目的:
　　高血壓是一種多基因遺傳和多種環(huán)境因素共同作用下的復(fù)雜疾病，是腦卒中、冠心病和心腎功能衰竭的主要原因。目前在我國(guó)高血壓主要為原發(fā)性高血壓，即多種環(huán)境和遺傳因素介導(dǎo)的原因不明的血壓升高。高血壓的發(fā)生機(jī)制包括神經(jīng)內(nèi)分泌機(jī)制、腎臟功能改變、血管功能紊亂、細(xì)胞膜離子轉(zhuǎn)運(yùn)異常等，其中組織離子穩(wěn)態(tài)失衡尤其是鈣信號(hào)的調(diào)控異常在原發(fā)性高血壓的發(fā)生中發(fā)揮重要作用，因此通過探究高血壓發(fā)生過程中相關(guān)陽離子通道的功能變化有助于高血壓的防控

2、。
　　鈣離子(Ca2+)是血管平滑肌細(xì)胞內(nèi)重要的信使物質(zhì)之一，參與調(diào)控血管平滑肌收縮、細(xì)胞增殖等并在高血壓中發(fā)揮重要作用。細(xì)胞內(nèi)Ca2+不僅能直接促進(jìn)血管收縮，還能夠作為細(xì)胞內(nèi)重要的第二信使在調(diào)控細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)發(fā)揮重要作用。近年研究發(fā)現(xiàn)一類新的離子通道——瞬時(shí)受體電位通道（Transient Receptor Potential Channel，TRP）在心血管代謝疾病中發(fā)揮重要作用。TRP通道是一類對(duì)鈉、鈣等陽離子通透的非選擇性

3、陽離子通道，它分為TRPCs，TRPVs及TRPMs等亞型，其中TRPC3作為TRPCs亞家族中的一員在心血管疾病中的作用備受關(guān)注，研究證實(shí)TRPC3主要分布于大腦中興奮性和非興奮性神經(jīng)元、感覺神經(jīng)元、心肌組織、肺組織、氣道平滑肌、垂體和血管平滑肌及內(nèi)皮組織等。目前關(guān)于TRPC3在高血壓中的作用研究較少，我們前期的研究證實(shí)TRPC3通過調(diào)控血管平滑肌鈣離子進(jìn)而影響血管功能和血壓，并首次在國(guó)際上報(bào)道了TRPC3在自發(fā)性高血壓大鼠(SHR)

4、主動(dòng)脈平滑肌組織及細(xì)胞中表達(dá)增強(qiáng)，且介導(dǎo)細(xì)胞鈣內(nèi)流增加與血管收縮反應(yīng)及血管振蕩運(yùn)動(dòng)增強(qiáng)有關(guān)，抑制血管組織TRPC3可抑制SHR腸系膜動(dòng)脈的血管振蕩運(yùn)動(dòng)。Ca2+是ROS產(chǎn)生的重要調(diào)節(jié)物，Ca2+信號(hào)和ROS間存在一種功能性的串話。線粒體是最早被認(rèn)識(shí)的鈣庫，線粒體外膜對(duì)Ca2+有較好的通透性，而內(nèi)膜的高度選擇通透性在維持線粒體膜電位和氧化磷酸化中發(fā)揮著重要的作用。線粒體內(nèi)過低的Ca2+濃度導(dǎo)致ATP生成減少，而過高的線粒體Ca2+濃度所引

5、發(fā)的Ca2+超載則導(dǎo)致ROS生成過多。線粒體Ca2+和線粒體ROS與高血壓的發(fā)生密切相關(guān)，研究證實(shí)高血壓時(shí)細(xì)胞能量狀態(tài)低下，且過度生成的ROS能夠通過轉(zhuǎn)錄和翻譯后調(diào)控細(xì)胞膜、線粒體及肌漿網(wǎng)上的L型鈣離子通道及鈣庫操縱的鈣內(nèi)流(Store Operate Calcium Entry，SOCE)的相關(guān)分子，進(jìn)而能夠直接影響血管功能。最近也有研究表明TRPC3也表達(dá)于成纖維細(xì)胞線粒體內(nèi)膜上，參與調(diào)控線粒體Ca2+穩(wěn)態(tài)。目前對(duì)血管平滑肌細(xì)胞線粒

6、體TRPC3表達(dá)及作用研究尚缺乏，尤其是高血壓時(shí)血管平滑肌細(xì)胞線粒體TRPC3表達(dá)及功能是否發(fā)生改變，調(diào)控線粒體TRPC3是否影響線粒體鈣攝取及線粒體功能進(jìn)而影響血管功能，亟需進(jìn)一步深入研究。
　　血管緊張素Ⅱ在高血壓及相關(guān)心血管疾病發(fā)生中起重要作用，除直接作用于AT1R，血管緊張素Ⅱ可作用于其他受體進(jìn)而對(duì)細(xì)胞的功能發(fā)揮調(diào)控作用。研究認(rèn)為線粒體上可能存在血管緊張素Ⅱ的受體，進(jìn)而對(duì)線粒體功能發(fā)揮直接的調(diào)控作用。我們前期研究證實(shí)TRP

7、C3參與高血壓的發(fā)生，血管緊張素Ⅱ能夠上調(diào)血管平滑肌細(xì)胞TRPC3的表達(dá)并促進(jìn)平滑肌細(xì)胞的鈣內(nèi)流增加，而替米沙坦干預(yù)能夠部分逆轉(zhuǎn)血管緊張素Ⅱ的作用。但血管緊張素Ⅱ和替米沙坦能否通過影響血管平滑肌線粒體TRPC3和線粒體鈣攝取，調(diào)控線粒體ROS生成改善血管平滑肌細(xì)胞收縮功能和血壓，有待進(jìn)一步深入闡明。
　　本研究包括三個(gè)部分:1.TRPC3在血管平滑肌細(xì)胞線粒體中的表達(dá)及功能。2.TRPC3調(diào)控血管平滑肌細(xì)胞線粒體功能對(duì)ROS生成和

8、血管收縮的作用。3.長(zhǎng)期替米沙坦干預(yù)抑制血管線粒體TRPC3對(duì)血壓和血管功能的作用及機(jī)制，分別觀察TRPC3在血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的高血壓中的作用及長(zhǎng)期替米沙坦干預(yù)對(duì)血管平滑肌線粒體TRPC3及SHR血壓和血管功能的作用及分子機(jī)制。我們通過SHR及其正常對(duì)照WKY大鼠和TRPC3-/-基因敲除小鼠，結(jié)合原代培養(yǎng)的主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞，明確線粒體TRPC3通過調(diào)控線粒體鈣攝取和線粒體ROS生成在高血壓中的作用，同時(shí)在整體水平利用替米沙坦進(jìn)行干預(yù)以

9、明確能否通過作用于線粒體TRPC3和線粒體鈣穩(wěn)態(tài)進(jìn)而改善血管功能及高血壓。
　　材料和方法:
　　整個(gè)研究包括離體實(shí)驗(yàn)和在體實(shí)驗(yàn)。前兩部分以SHR及WKY大鼠原代培養(yǎng)的主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞為主要研究對(duì)象，明確線粒體TRPC3的表達(dá)及功能，闡明線粒體TRPC3在調(diào)控SHR血管平滑肌線粒體功能及血管收縮中的作用。第三部分在體實(shí)驗(yàn)，用TRPC3-/-小鼠及其同窩野生型小鼠作對(duì)照，給予血管緊張素Ⅱ灌注制造高血壓模型，明確TRPC3在血管

10、緊張素Ⅱ介導(dǎo)的血管平滑肌線粒體功能紊亂和血管收縮反應(yīng)增強(qiáng)中的作用;第四部分通過觀察長(zhǎng)期替米沙坦干預(yù)對(duì)SHR及正常血壓WKY大鼠的作用，明確長(zhǎng)期替米沙坦干預(yù)對(duì)血管平滑肌線粒體TRPC3的作用及改善血管線粒體功能和血管收縮功能及血壓的影響。實(shí)驗(yàn)主要方法如下:
　　1.無創(chuàng)鼠尾血壓和植入子血壓遙測(cè)技術(shù)明確WKY、SHR及TRPC3-/-小鼠在不同干預(yù)條件下鼠尾及24h動(dòng)態(tài)血壓的變化情況;
　　2.小血管張力實(shí)驗(yàn)明確SHR及TRPC

11、3-/-小鼠腸系膜動(dòng)脈對(duì)不同干預(yù)因素下腸系膜動(dòng)脈收縮及舒張功能的變化情況;
　　3.采用熒光比率儀和全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀明確上述干預(yù)因素對(duì)血管組織、血管平滑肌細(xì)胞的細(xì)胞水平和線粒體水平鈣攝取情況;
　　4.qPCR、免疫印跡和免疫熒光實(shí)驗(yàn)檢測(cè)TRPC3、丙酮酸脫氫酶、RhoA/Rho kinase通路相關(guān)蛋白的表達(dá)及分布;
　　5.高分辨率線粒體呼吸功能測(cè)定及其他氧化還原指標(biāo)測(cè)定明確上述因素對(duì)血管平滑肌細(xì)胞及組織線粒體呼吸功能

12、、ATP生成及ROS生成等指標(biāo)的影響;
　　結(jié)果:
　　1.TRPC3表達(dá)于血管平滑肌細(xì)胞線粒體中，SHR血管平滑肌細(xì)胞線粒體TRPC3表達(dá)增強(qiáng)，其介導(dǎo)的線粒體的[Ca2+]m攝取增加。替米沙坦能抑制SHR血管平滑肌線粒體TRPC3表達(dá)及線粒體鈣攝取。
　　2.SHR血管平滑肌線粒體TRPC3表達(dá)增強(qiáng)，促進(jìn)線粒體ROS生成，抑制ATP合成及線粒體呼吸功能，進(jìn)而導(dǎo)致SHR血管收縮功能增強(qiáng)。TRPC3抑制劑Pyr3或替米沙

13、坦干預(yù)能夠通過抑制TRPC3部分逆轉(zhuǎn)上述病理改變。
　　3.TRPC3基因敲除削弱血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的高血壓。以TRPC3/小鼠及其同窩野生型WT小鼠為觀察對(duì)象，給予血管緊張素Ⅱ灌注14天，發(fā)現(xiàn)TRPC3-/-可削弱血管緊張素Ⅱ介導(dǎo)的血管收縮反應(yīng)增強(qiáng)和血壓升高的作用。
　　4.TRPC3-/-能夠部分改善血管緊張素Ⅱ介導(dǎo)的線粒體鈣超載、PDH抑制及線粒體功能受損;TRPC3-/-可抑制血管緊張素Ⅱ介導(dǎo)的RhoA/Rho kin

14、ase激活及ROS生成。
　　5.替米沙坦干預(yù)SHR能抑制血管平滑肌線粒體TRPC3通過改善線粒體功能、減少ROS生成和血管收縮功能，進(jìn)而改善高血壓。
　　結(jié)論:
　　1.TRPC3在血管平滑肌細(xì)胞線粒體中有表達(dá)，抑制血管線粒體TRPC3能減少血管平滑肌細(xì)胞線粒體鈣攝取。
　　2.高血壓時(shí)血管線粒體TRPC3表達(dá)增強(qiáng)，促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞線粒體鈣攝取、ROS生成增加，促進(jìn)血管收縮，提示血管平滑肌線粒體TRPC3參與