TRPC3通道調控血管平滑肌線粒體功能在高血壓中的作用及機制.pdf

1、背景和目的:
　　高血壓是一種多基因遺傳和多種環(huán)境因素共同作用下的復雜疾病，是腦卒中、冠心病和心腎功能衰竭的主要原因。目前在我國高血壓主要為原發(fā)性高血壓，即多種環(huán)境和遺傳因素介導的原因不明的血壓升高。高血壓的發(fā)生機制包括神經內分泌機制、腎臟功能改變、血管功能紊亂、細胞膜離子轉運異常等，其中組織離子穩(wěn)態(tài)失衡尤其是鈣信號的調控異常在原發(fā)性高血壓的發(fā)生中發(fā)揮重要作用，因此通過探究高血壓發(fā)生過程中相關陽離子通道的功能變化有助于高血壓的防控

2、。
　　鈣離子(Ca2+)是血管平滑肌細胞內重要的信使物質之一，參與調控血管平滑肌收縮、細胞增殖等并在高血壓中發(fā)揮重要作用。細胞內Ca2+不僅能直接促進血管收縮，還能夠作為細胞內重要的第二信使在調控細胞信號轉導發(fā)揮重要作用。近年研究發(fā)現(xiàn)一類新的離子通道——瞬時受體電位通道（Transient Receptor Potential Channel，TRP）在心血管代謝疾病中發(fā)揮重要作用。TRP通道是一類對鈉、鈣等陽離子通透的非選擇性

3、陽離子通道，它分為TRPCs，TRPVs及TRPMs等亞型，其中TRPC3作為TRPCs亞家族中的一員在心血管疾病中的作用備受關注，研究證實TRPC3主要分布于大腦中興奮性和非興奮性神經元、感覺神經元、心肌組織、肺組織、氣道平滑肌、垂體和血管平滑肌及內皮組織等。目前關于TRPC3在高血壓中的作用研究較少，我們前期的研究證實TRPC3通過調控血管平滑肌鈣離子進而影響血管功能和血壓，并首次在國際上報道了TRPC3在自發(fā)性高血壓大鼠(SHR)

4、主動脈平滑肌組織及細胞中表達增強，且介導細胞鈣內流增加與血管收縮反應及血管振蕩運動增強有關，抑制血管組織TRPC3可抑制SHR腸系膜動脈的血管振蕩運動。Ca2+是ROS產生的重要調節(jié)物，Ca2+信號和ROS間存在一種功能性的串話。線粒體是最早被認識的鈣庫，線粒體外膜對Ca2+有較好的通透性，而內膜的高度選擇通透性在維持線粒體膜電位和氧化磷酸化中發(fā)揮著重要的作用。線粒體內過低的Ca2+濃度導致ATP生成減少，而過高的線粒體Ca2+濃度所引

5、發(fā)的Ca2+超載則導致ROS生成過多。線粒體Ca2+和線粒體ROS與高血壓的發(fā)生密切相關，研究證實高血壓時細胞能量狀態(tài)低下，且過度生成的ROS能夠通過轉錄和翻譯后調控細胞膜、線粒體及肌漿網上的L型鈣離子通道及鈣庫操縱的鈣內流(Store Operate Calcium Entry，SOCE)的相關分子，進而能夠直接影響血管功能。最近也有研究表明TRPC3也表達于成纖維細胞線粒體內膜上，參與調控線粒體Ca2+穩(wěn)態(tài)。目前對血管平滑肌細胞線粒

6、體TRPC3表達及作用研究尚缺乏，尤其是高血壓時血管平滑肌細胞線粒體TRPC3表達及功能是否發(fā)生改變，調控線粒體TRPC3是否影響線粒體鈣攝取及線粒體功能進而影響血管功能，亟需進一步深入研究。
　　血管緊張素Ⅱ在高血壓及相關心血管疾病發(fā)生中起重要作用，除直接作用于AT1R，血管緊張素Ⅱ可作用于其他受體進而對細胞的功能發(fā)揮調控作用。研究認為線粒體上可能存在血管緊張素Ⅱ的受體，進而對線粒體功能發(fā)揮直接的調控作用。我們前期研究證實TRP

7、C3參與高血壓的發(fā)生，血管緊張素Ⅱ能夠上調血管平滑肌細胞TRPC3的表達并促進平滑肌細胞的鈣內流增加，而替米沙坦干預能夠部分逆轉血管緊張素Ⅱ的作用。但血管緊張素Ⅱ和替米沙坦能否通過影響血管平滑肌線粒體TRPC3和線粒體鈣攝取，調控線粒體ROS生成改善血管平滑肌細胞收縮功能和血壓，有待進一步深入闡明。
　　本研究包括三個部分:1.TRPC3在血管平滑肌細胞線粒體中的表達及功能。2.TRPC3調控血管平滑肌細胞線粒體功能對ROS生成和

8、血管收縮的作用。3.長期替米沙坦干預抑制血管線粒體TRPC3對血壓和血管功能的作用及機制，分別觀察TRPC3在血管緊張素Ⅱ誘導的高血壓中的作用及長期替米沙坦干預對血管平滑肌線粒體TRPC3及SHR血壓和血管功能的作用及分子機制。我們通過SHR及其正常對照WKY大鼠和TRPC3-/-基因敲除小鼠，結合原代培養(yǎng)的主動脈平滑肌細胞，明確線粒體TRPC3通過調控線粒體鈣攝取和線粒體ROS生成在高血壓中的作用，同時在整體水平利用替米沙坦進行干預以

9、明確能否通過作用于線粒體TRPC3和線粒體鈣穩(wěn)態(tài)進而改善血管功能及高血壓。
　　材料和方法:
　　整個研究包括離體實驗和在體實驗。前兩部分以SHR及WKY大鼠原代培養(yǎng)的主動脈平滑肌細胞為主要研究對象，明確線粒體TRPC3的表達及功能，闡明線粒體TRPC3在調控SHR血管平滑肌線粒體功能及血管收縮中的作用。第三部分在體實驗，用TRPC3-/-小鼠及其同窩野生型小鼠作對照，給予血管緊張素Ⅱ灌注制造高血壓模型，明確TRPC3在血管

10、緊張素Ⅱ介導的血管平滑肌線粒體功能紊亂和血管收縮反應增強中的作用;第四部分通過觀察長期替米沙坦干預對SHR及正常血壓WKY大鼠的作用，明確長期替米沙坦干預對血管平滑肌線粒體TRPC3的作用及改善血管線粒體功能和血管收縮功能及血壓的影響。實驗主要方法如下:
　　1.無創(chuàng)鼠尾血壓和植入子血壓遙測技術明確WKY、SHR及TRPC3-/-小鼠在不同干預條件下鼠尾及24h動態(tài)血壓的變化情況;
　　2.小血管張力實驗明確SHR及TRPC

11、3-/-小鼠腸系膜動脈對不同干預因素下腸系膜動脈收縮及舒張功能的變化情況;
　　3.采用熒光比率儀和全波長酶標儀明確上述干預因素對血管組織、血管平滑肌細胞的細胞水平和線粒體水平鈣攝取情況;
　　4.qPCR、免疫印跡和免疫熒光實驗檢測TRPC3、丙酮酸脫氫酶、RhoA/Rho kinase通路相關蛋白的表達及分布;
　　5.高分辨率線粒體呼吸功能測定及其他氧化還原指標測定明確上述因素對血管平滑肌細胞及組織線粒體呼吸功能

12、、ATP生成及ROS生成等指標的影響;
　　結果:
　　1.TRPC3表達于血管平滑肌細胞線粒體中，SHR血管平滑肌細胞線粒體TRPC3表達增強，其介導的線粒體的[Ca2+]m攝取增加。替米沙坦能抑制SHR血管平滑肌線粒體TRPC3表達及線粒體鈣攝取。
　　2.SHR血管平滑肌線粒體TRPC3表達增強，促進線粒體ROS生成，抑制ATP合成及線粒體呼吸功能，進而導致SHR血管收縮功能增強。TRPC3抑制劑Pyr3或替米沙

13、坦干預能夠通過抑制TRPC3部分逆轉上述病理改變。
　　3.TRPC3基因敲除削弱血管緊張素Ⅱ誘導的高血壓。以TRPC3/小鼠及其同窩野生型WT小鼠為觀察對象，給予血管緊張素Ⅱ灌注14天，發(fā)現(xiàn)TRPC3-/-可削弱血管緊張素Ⅱ介導的血管收縮反應增強和血壓升高的作用。
　　4.TRPC3-/-能夠部分改善血管緊張素Ⅱ介導的線粒體鈣超載、PDH抑制及線粒體功能受損;TRPC3-/-可抑制血管緊張素Ⅱ介導的RhoA/Rho kin

14、ase激活及ROS生成。
　　5.替米沙坦干預SHR能抑制血管平滑肌線粒體TRPC3通過改善線粒體功能、減少ROS生成和血管收縮功能，進而改善高血壓。
　　結論:
　　1.TRPC3在血管平滑肌細胞線粒體中有表達，抑制血管線粒體TRPC3能減少血管平滑肌細胞線粒體鈣攝取。
　　2.高血壓時血管線粒體TRPC3表達增強，促進血管平滑肌細胞線粒體鈣攝取、ROS生成增加，促進血管收縮，提示血管平滑肌線粒體TRPC3參與