補中益氣湯經腸道SGLT1-NHE3調控作用治療脾虛泄瀉證的機制研究.pdf

1、研究目的：
　　補中益氣湯出自李東垣的《內外傷辨惑論》，是臨床上常用于脾胃氣虛，清陽下陷等證，為補中益氣、升陽舉陷的代表方。白術是補中益氣湯主要組成藥物之一，白術內酯Ⅰ(AtractylenolideⅠ)是白術健脾的主要有效成分之一，以往研究發(fā)現補中益氣湯及白術內酯Ⅰ對脾虛泄瀉患者和（或）動物的消化、吸收等功能有著促進作用。本實驗擬通過建立脾虛泄瀉大鼠模型及Caco-2細胞模型，探討脾虛泄瀉大鼠小腸葡萄糖吸收障礙及SGLT1/NH

2、E3通路的變化，并觀察補中益氣湯、白術內酯Ⅰ對其的干預作用，以期從分子水平闡明補中益氣湯治療脾虛泄瀉的作用機制。
　　研究方法：
　　實驗研究以“大黃+利血平+控制飲食”多因素法建立脾虛泄瀉大鼠模型，隨機分組為正常對照組、脾虛泄瀉模型組和補中益氣湯低、中、高劑量組，觀察大鼠造模及給藥后一般情況變化、泄瀉指數、D-木糖排泄率及小腸葡萄糖吸收含量，HE染色觀察大鼠小腸黏膜病理學改變，westernblot法檢測鈉依賴性葡萄糖轉運

3、體(SGLT1)、葡萄糖轉運體2(GLUT2)、鈉氫交換體3(NHE3)、P38MAPK、P-P38MAPK、MAPKAPK2、P-MAPKAPK2、Akt2、P-Akt2、Ezrin、P-Ezrin蛋白的表達，熒光定量RT-PCR檢測鈉依賴性葡萄糖轉運體(SGLT1)、葡萄糖轉運體2(GLUT2)、鈉氫交換體3(NHE3) mRNA的表達。
　　白術內酯Ⅰ對SGLT1/NHE3及MLCK/MLC通路的影響:采用Caco-2細胞模

4、型，用根皮苷(PZ，Phlorizin)、SB203580、NSC668394分別阻斷SGLT1、P38MAPK、Ezrin后，再加入白術內酯Ⅰ進行干預，觀察其對NHE3和（或）MLCK、P-MLC磷酸化的影響。
　　研究結果：
　　1.大鼠體重變化及尿D-木糖排泄率:造模前，正常對照組與造模組體質量及尿D-木糖排泄率無明顯差異(P＞0.05)，造模結束后，造模組的體重及尿D-木糖排泄率明顯下降，與正常組比較差異有統(tǒng)計學意義

5、(P＜0.01)。給予補中益氣湯治療后，給藥組體重尿D-木糖排泄率均有所增加，但體重變化各組之間差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05);尿D-木糖排泄率以補中益氣湯高劑量組改善最為明顯，與模型組比較有統(tǒng)計學差異(P＜0.05)。
　　2.大鼠腹瀉指數及小腸葡萄糖吸收量:造模后，大鼠腹瀉指數升高，葡萄糖吸收量下降(P＜0.05)。給與補中益氣湯后，各給藥組腹瀉癥狀均逐漸減輕，腹瀉指數降低，小腸葡萄糖吸收量有所提高，且呈劑量依賴性，其中以補

6、中益氣湯中劑量或高劑量組較為明顯(P＜0.05或P＜0.01)。
　　3.小腸粘膜病理學及Na+-K+ATP酶活性的改變:模型組大鼠小腸絨毛形態(tài)部分損傷，上皮細胞缺失，間質炎癥細胞浸潤，小腸絨毛的高度及寬度均明顯降低(P＜0.01)，且小腸粘膜Na+-K+ATP酶活性下降(P＜0.01)。經補中益氣湯干預后小腸粘膜修復明顯，絨毛的高度及寬度均可見升高(P＜0.01)，小腸粘膜Na+-K+ATP酶活性增強，且呈劑量依賴性，其中以補中

7、益氣中、高劑量組療效較好(P＜0.01)。
　　4.補中益氣湯對脾虛泄瀉大鼠SHLT1/NHE3通路相關蛋白及基因表達的影響:模型組大鼠小腸黏膜中SGLT1、GLUT2、NHE3mRNA及蛋白表達量降低(P＜0.01或P＜0.05)，P38MAPK/Ezrin通路相關蛋白P38MAPK、MAPKAPK2、Akt2、Ezrin的表達量在各組之間無明顯變化(P＞0.05)，但P-P38MAPK、P-MAPKAPK2、P-Akt2、P-

8、Ezrin蛋白表達量較正常組減低(P＜0.01)，給予補中益氣湯后，SGLT1、GLUT2、NHE3mRNA及蛋白，P-P38MAPK、P-MAPKAPK2、P-Akt2、P-Ezrin蛋白表達量均有所提高(P＜0.05)，且以高劑量組最為明顯。
　　5.白術內酯Ⅰ對Caco-2細胞SHLT1/NHE3通路相關蛋白表達的影響:在使用PZ抑制SGLT1后，Caco2細胞SGLT1、NHE3mRNA和蛋白表達下調(P＜0.05)，P3

9、8MAPK/EZRIN通路磷酸化減少，白術內酯Ⅰ可使SGLT1和NHE3mRNA和蛋白表達增加(P＜0.05)，且能使SGLT1通路下游蛋白P38MAPK、MAPKAPK、Akt2、Ezrin磷酸化增加(P＜0.01或P＜0.05)，加入SB203580或NSC668394阻斷P38MAPK或Ezrin蛋白后，NHE3mRNA及蛋白表達下調(P＜0.05)，給予白術內酯Ⅰ后NHE3表達增加(P＜0.01)，說明白術內酯Ⅰ可能不是通過P3

10、8MAPK、Ezrin來促進NHE3的表達。
　　6.白術內酯Ⅰ對Caco-2細胞MLCK/MLC通路相關蛋白表達的影響:在使用PZ抑制SGLT1后，Caco2細胞MLCKmRNA及蛋白表達減少，MLC磷酸化降低(P＜0.01或P＜0.05)，給予白術內酯Ⅰ后MLCK表達及MLC磷酸化增加(P＜0.05)，說明白術內酯Ⅰ可通過促進SGLT1的表達上調MLCK表達及MLC磷酸化，加入SB203580阻斷P38MAPK后，MLCKmR

11、NA及蛋白表達減少，MLC磷酸化降低(P＜0.05)，給予白術內酯Ⅰ后MLCK表達增加(P＜0.01)，說明白術內酯Ⅰ可能不是通過P38MAPK來促進MLCK表達及MLC磷酸化增加。
　　研究結論：
　　1.脾虛泄瀉大鼠體質量及D-木糖排泄率、葡萄糖吸收率較對照組下降，腹瀉指數升高，小腸絨毛損傷及Na+-K+ATP酶的活性的降低。補中益氣湯可以改善脾虛泄瀉大鼠腹瀉癥狀，增加脾虛大鼠的體質量、D-木糖排泄率及葡萄糖吸收量，促進

12、脾虛泄瀉大鼠小腸粘膜損傷的修復及腸粘膜Na+-K+ATP酶的活性。
　　2.脾虛泄瀉大鼠SGLT1和GLUT2、NHE3蛋白和mRNA的表達下調，P38MAPK/Ezrin通路中蛋白的磷酸化降低，補中益氣湯能通過提高SGLT1蛋白的表達，增加P38MAPK/Ezrin通路的磷酸化，促進NHE3蛋白表達增加，這可能是補中益氣湯治療脾虛泄瀉的機理之一。
　　3.在Caco-2細胞中，使用根皮苷(PZ，Phlorizin)抑制SG

13、LT1后出現SGLT1、NHE3mRNA及蛋白表達下調，P38MAPK/Ezrin通路中蛋白的磷酸化降低，抑制P38MAPK及Ezrin可出現NHE3mRNA及蛋白表達的降低，白術內酯Ⅰ可促進SGLT1的表達，進而促進P38MAPK/Ezrin通路的磷酸化，增加NHE3的表達。
　　4.在Caco-2細胞中，抑制SGLT1或P38MAPK出現MLCKmRNA和蛋白表達下調，MLC磷酸化降低，白術內酯Ⅰ可通過增加SGLT1表達促進M