補(bǔ)中益氣湯經(jīng)腸道SGLT1-NHE3調(diào)控作用治療脾虛泄瀉證的機(jī)制研究.pdf

1、研究目的：
　　補(bǔ)中益氣湯出自李東垣的《內(nèi)外傷辨惑論》，是臨床上常用于脾胃氣虛，清陽下陷等證，為補(bǔ)中益氣、升陽舉陷的代表方。白術(shù)是補(bǔ)中益氣湯主要組成藥物之一，白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ(AtractylenolideⅠ)是白術(shù)健脾的主要有效成分之一，以往研究發(fā)現(xiàn)補(bǔ)中益氣湯及白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ對脾虛泄瀉患者和（或）動物的消化、吸收等功能有著促進(jìn)作用。本實驗擬通過建立脾虛泄瀉大鼠模型及Caco-2細(xì)胞模型，探討脾虛泄瀉大鼠小腸葡萄糖吸收障礙及SGLT1/NH

2、E3通路的變化，并觀察補(bǔ)中益氣湯、白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ對其的干預(yù)作用，以期從分子水平闡明補(bǔ)中益氣湯治療脾虛泄瀉的作用機(jī)制。
　　研究方法：
　　實驗研究以“大黃+利血平+控制飲食”多因素法建立脾虛泄瀉大鼠模型，隨機(jī)分組為正常對照組、脾虛泄瀉模型組和補(bǔ)中益氣湯低、中、高劑量組，觀察大鼠造模及給藥后一般情況變化、泄瀉指數(shù)、D-木糖排泄率及小腸葡萄糖吸收含量，HE染色觀察大鼠小腸黏膜病理學(xué)改變，westernblot法檢測鈉依賴性葡萄糖轉(zhuǎn)運

3、體(SGLT1)、葡萄糖轉(zhuǎn)運體2(GLUT2)、鈉氫交換體3(NHE3)、P38MAPK、P-P38MAPK、MAPKAPK2、P-MAPKAPK2、Akt2、P-Akt2、Ezrin、P-Ezrin蛋白的表達(dá)，熒光定量RT-PCR檢測鈉依賴性葡萄糖轉(zhuǎn)運體(SGLT1)、葡萄糖轉(zhuǎn)運體2(GLUT2)、鈉氫交換體3(NHE3) mRNA的表達(dá)。
　　白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ對SGLT1/NHE3及MLCK/MLC通路的影響:采用Caco-2細(xì)胞模

4、型，用根皮苷(PZ，Phlorizin)、SB203580、NSC668394分別阻斷SGLT1、P38MAPK、Ezrin后，再加入白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ進(jìn)行干預(yù)，觀察其對NHE3和（或）MLCK、P-MLC磷酸化的影響。
　　研究結(jié)果：
　　1.大鼠體重變化及尿D-木糖排泄率:造模前，正常對照組與造模組體質(zhì)量及尿D-木糖排泄率無明顯差異(P＞0.05)，造模結(jié)束后，造模組的體重及尿D-木糖排泄率明顯下降，與正常組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義

5、(P＜0.01)。給予補(bǔ)中益氣湯治療后，給藥組體重尿D-木糖排泄率均有所增加，但體重變化各組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05);尿D-木糖排泄率以補(bǔ)中益氣湯高劑量組改善最為明顯，與模型組比較有統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05)。
　　2.大鼠腹瀉指數(shù)及小腸葡萄糖吸收量:造模后，大鼠腹瀉指數(shù)升高，葡萄糖吸收量下降(P＜0.05)。給與補(bǔ)中益氣湯后，各給藥組腹瀉癥狀均逐漸減輕，腹瀉指數(shù)降低，小腸葡萄糖吸收量有所提高，且呈劑量依賴性，其中以補(bǔ)

6、中益氣湯中劑量或高劑量組較為明顯(P＜0.05或P＜0.01)。
　　3.小腸粘膜病理學(xué)及Na+-K+ATP酶活性的改變:模型組大鼠小腸絨毛形態(tài)部分損傷，上皮細(xì)胞缺失，間質(zhì)炎癥細(xì)胞浸潤，小腸絨毛的高度及寬度均明顯降低(P＜0.01)，且小腸粘膜Na+-K+ATP酶活性下降(P＜0.01)。經(jīng)補(bǔ)中益氣湯干預(yù)后小腸粘膜修復(fù)明顯，絨毛的高度及寬度均可見升高(P＜0.01)，小腸粘膜Na+-K+ATP酶活性增強(qiáng)，且呈劑量依賴性，其中以補(bǔ)中

7、益氣中、高劑量組療效較好(P＜0.01)。
　　4.補(bǔ)中益氣湯對脾虛泄瀉大鼠SHLT1/NHE3通路相關(guān)蛋白及基因表達(dá)的影響:模型組大鼠小腸黏膜中SGLT1、GLUT2、NHE3mRNA及蛋白表達(dá)量降低(P＜0.01或P＜0.05)，P38MAPK/Ezrin通路相關(guān)蛋白P38MAPK、MAPKAPK2、Akt2、Ezrin的表達(dá)量在各組之間無明顯變化(P＞0.05)，但P-P38MAPK、P-MAPKAPK2、P-Akt2、P-

8、Ezrin蛋白表達(dá)量較正常組減低(P＜0.01)，給予補(bǔ)中益氣湯后，SGLT1、GLUT2、NHE3mRNA及蛋白，P-P38MAPK、P-MAPKAPK2、P-Akt2、P-Ezrin蛋白表達(dá)量均有所提高(P＜0.05)，且以高劑量組最為明顯。
　　5.白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ對Caco-2細(xì)胞SHLT1/NHE3通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響:在使用PZ抑制SGLT1后，Caco2細(xì)胞SGLT1、NHE3mRNA和蛋白表達(dá)下調(diào)(P＜0.05)，P3

9、8MAPK/EZRIN通路磷酸化減少，白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ可使SGLT1和NHE3mRNA和蛋白表達(dá)增加(P＜0.05)，且能使SGLT1通路下游蛋白P38MAPK、MAPKAPK、Akt2、Ezrin磷酸化增加(P＜0.01或P＜0.05)，加入SB203580或NSC668394阻斷P38MAPK或Ezrin蛋白后，NHE3mRNA及蛋白表達(dá)下調(diào)(P＜0.05)，給予白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ后NHE3表達(dá)增加(P＜0.01)，說明白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ可能不是通過P3

10、8MAPK、Ezrin來促進(jìn)NHE3的表達(dá)。
　　6.白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ對Caco-2細(xì)胞MLCK/MLC通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響:在使用PZ抑制SGLT1后，Caco2細(xì)胞MLCKmRNA及蛋白表達(dá)減少，MLC磷酸化降低(P＜0.01或P＜0.05)，給予白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ后MLCK表達(dá)及MLC磷酸化增加(P＜0.05)，說明白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ可通過促進(jìn)SGLT1的表達(dá)上調(diào)MLCK表達(dá)及MLC磷酸化，加入SB203580阻斷P38MAPK后，MLCKmR

11、NA及蛋白表達(dá)減少，MLC磷酸化降低(P＜0.05)，給予白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ后MLCK表達(dá)增加(P＜0.01)，說明白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ可能不是通過P38MAPK來促進(jìn)MLCK表達(dá)及MLC磷酸化增加。
　　研究結(jié)論：
　　1.脾虛泄瀉大鼠體質(zhì)量及D-木糖排泄率、葡萄糖吸收率較對照組下降，腹瀉指數(shù)升高，小腸絨毛損傷及Na+-K+ATP酶的活性的降低。補(bǔ)中益氣湯可以改善脾虛泄瀉大鼠腹瀉癥狀，增加脾虛大鼠的體質(zhì)量、D-木糖排泄率及葡萄糖吸收量，促進(jìn)

12、脾虛泄瀉大鼠小腸粘膜損傷的修復(fù)及腸粘膜Na+-K+ATP酶的活性。
　　2.脾虛泄瀉大鼠SGLT1和GLUT2、NHE3蛋白和mRNA的表達(dá)下調(diào)，P38MAPK/Ezrin通路中蛋白的磷酸化降低，補(bǔ)中益氣湯能通過提高SGLT1蛋白的表達(dá)，增加P38MAPK/Ezrin通路的磷酸化，促進(jìn)NHE3蛋白表達(dá)增加，這可能是補(bǔ)中益氣湯治療脾虛泄瀉的機(jī)理之一。
　　3.在Caco-2細(xì)胞中，使用根皮苷(PZ，Phlorizin)抑制SG

13、LT1后出現(xiàn)SGLT1、NHE3mRNA及蛋白表達(dá)下調(diào)，P38MAPK/Ezrin通路中蛋白的磷酸化降低，抑制P38MAPK及Ezrin可出現(xiàn)NHE3mRNA及蛋白表達(dá)的降低，白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ可促進(jìn)SGLT1的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)P38MAPK/Ezrin通路的磷酸化，增加NHE3的表達(dá)。
　　4.在Caco-2細(xì)胞中，抑制SGLT1或P38MAPK出現(xiàn)MLCKmRNA和蛋白表達(dá)下調(diào)，MLC磷酸化降低，白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ可通過增加SGLT1表達(dá)促進(jìn)M