CAPZA1 3’UTR突變及高表達(dá)在食管鱗癌發(fā)生發(fā)展中的功能和機(jī)制研究.pdf

1、食管癌是一種常見的惡性度較高的腫瘤。中國作為食管癌的高發(fā)區(qū)，其臨床組織病理類型主要為食管鱗狀細(xì)胞癌(esophageal squamous cell carcinoma，ESCC)，基于缺乏較好的診斷和治療的手段而造成的預(yù)后效果差、生存率低的現(xiàn)狀，從分子水平探索ESCC的發(fā)生發(fā)展機(jī)制已經(jīng)成為目前的研究熱點(diǎn)。
　　通過對實(shí)驗(yàn)室前期關(guān)于食管鱗癌的全基因組測序和全外顯子測序結(jié)果的深入分析，挑選同時(shí)存在拷貝數(shù)變異及3'UTR區(qū)單核苷酸突變

2、的CAPZA1基因進(jìn)行研究。目前CAPZA1在ESCC中的生物學(xué)功能及分子機(jī)制尚未報(bào)道，CAPZA13'UTR突變的研究更是鮮有報(bào)道。CAP ZA1在154個(gè)樣本中，有9個(gè)(5.84％)樣本發(fā)生了拷貝數(shù)缺失，只有1個(gè)(0.65％)樣本出現(xiàn)拷貝數(shù)擴(kuò)增。通過TCGA數(shù)據(jù)庫，發(fā)現(xiàn)CAPZA1在其他腫瘤中也存在較多的拷貝數(shù)缺失。通過構(gòu)建穩(wěn)定高表達(dá)野生型和突變性CAP ZA1的細(xì)胞模型，在細(xì)胞水平和裸鼠模型中深入研究CAPZA1的生物學(xué)功能，發(fā)現(xiàn)

3、高表達(dá)CAP ZA1抑制細(xì)胞生長增殖、克隆形成、遷移和侵襲能力，抑制裸鼠成瘤和血行肺轉(zhuǎn)移的能力，而CAPZA13'UTR突變后減弱CAPZA1的抑癌功能，同時(shí)敲降CAPZA1后明顯促進(jìn)細(xì)胞增殖、克隆形成、細(xì)胞遷移和侵襲能力。野生型的CAPZA1mRNA穩(wěn)定性明顯高于突變型的mRNA，且突變型CAPZA1mRNA二級結(jié)構(gòu)包含更多的頸環(huán)結(jié)構(gòu)。隨后通過biotin-RNA pulldown試驗(yàn)結(jié)合質(zhì)譜分析，RIP和IP試驗(yàn)篩選與野生型及突變型

4、CAPZA1mRNA差異結(jié)合的RNA結(jié)合蛋白，發(fā)現(xiàn)PTBP1、hnRNP K可以特異性與野生型mRNA結(jié)合，而UPF1可以與突變型mRNA特異性結(jié)合，并且PTBP1、hnRNPK和UPF1三者可以通過相互作用來參與mRNA穩(wěn)定性的調(diào)控。
　　真核生物3'非翻譯區(qū)(3'untranslated regions，3'UTRs)主要通過參與調(diào)控mRNA的多種代謝，目前已經(jīng)有研究發(fā)現(xiàn)3'UTR可以作為獨(dú)立的RNA分子發(fā)揮來發(fā)揮功能，但是其

5、具體的分子機(jī)制還尚不明確，尤其在食管鱗癌中CAPZA13'UTR單獨(dú)發(fā)揮的作用仍無研究報(bào)道。
　　通過RACE PCR和northern blot試驗(yàn)驗(yàn)證在ESCC中3'UTR單獨(dú)轉(zhuǎn)錄，且其表達(dá)不影響CAPZA1mRNA和蛋白水平，這在數(shù)據(jù)庫中還尚未注釋。隨后，在研究3'UTR對ESCC細(xì)胞惡性表型的影響中發(fā)現(xiàn)單獨(dú)高表達(dá)3'UTR可以明顯促進(jìn)ESCC細(xì)胞生長增殖、克隆形成能力、遷移和侵襲能力，減弱UV誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，而3'UTR突

6、變后會減弱這種促癌作用。預(yù)測發(fā)現(xiàn)3'UTR不具有翻譯能力，且3'UTR突變后其RNA轉(zhuǎn)錄本的二級結(jié)構(gòu)包含了更多的頸環(huán)結(jié)構(gòu)。運(yùn)用biotin-RNApull-down、RIP和IP試驗(yàn)尋找與3'UTR相互結(jié)合的蛋白，發(fā)現(xiàn)IGF2BPs蛋白可以與野生型3'UTR特異性結(jié)合。研究報(bào)道，IGF2BPs在腫瘤的惡性轉(zhuǎn)化中發(fā)揮重要的功能。因此3'UTR可能通過結(jié)合IGF2BPs蛋白進(jìn)而上調(diào)IGF2BPs下游通路C-Myc蛋白的水平發(fā)揮促癌功能，作為

7、獨(dú)立的分子行使促癌的功能。
　　綜上所述，本課題首次從細(xì)胞學(xué)功能和分子機(jī)制等多個(gè)層面系統(tǒng)而深入地揭示CAPZA1和3'UTR作為獨(dú)立的RNA分子在食管鱗癌發(fā)生發(fā)展中的分子功能及作用機(jī)制。CAPZA1具有抑癌基因的功能，且其YUTR突變是一種功能缺失(loss of function)的突變，可以通過UPF1依賴的方式促進(jìn)mRNA降解，從而在ESCC的惡性進(jìn)展中發(fā)揮功能，這個(gè)過程是受hnRNPK和PTBP1蛋白調(diào)控。此外，CAPZA