真核系統(tǒng)中Hsp60的表達(dá)、純化和糖基化修飾及可溶性CLEC-2產(chǎn)生和調(diào)控的研究.pdf

1、第一部分：真核系統(tǒng)中Hsp60的表達(dá)、純化和糖基化修飾研究
　　人熱休克蛋白60(Heat shock protein 60)最初被認(rèn)為是一種定位在線粒體的蛋白質(zhì)，在體內(nèi)發(fā)揮分子伴侶的功能。近年來，越來越多的研究開始關(guān)注細(xì)胞表面和釋放到細(xì)胞外的Hsp60的功能。在免疫系統(tǒng)中，Hsp60被認(rèn)為是一種危險(xiǎn)信號。然而，由于以往研究中所用的Hsp60主要來源于原核系統(tǒng)，可能會污染有LPS等細(xì)菌成分，所以也有研究認(rèn)為Hsp60所引起的免疫反

2、應(yīng)可能與這些污染的原核成分有關(guān)。在本研究中，我們用分泌信號肽替換了Hsp60基因序列中原有的線粒體定位信號肽，構(gòu)建了真核系統(tǒng)Hsp60的表達(dá)質(zhì)粒，應(yīng)用真核表達(dá)系統(tǒng)獲得了分泌的Hsp60蛋白，并驗(yàn)證了目的蛋白與巨噬細(xì)胞的結(jié)合能力。同時(shí)，我們在研究中發(fā)現(xiàn)，經(jīng)真核分泌途徑獲得的Hsp60會發(fā)生N-糖基化修飾，并且N-糖鏈并非連接在經(jīng)典三聯(lián)子序列(Asn-X-Ser/Thr)中的天冬酰胺上，提示Hsp60氨基酸序列中可能存在非經(jīng)典的N.糖基化修

3、飾位點(diǎn)。
　　第二部分：可溶性形式C型凝集素樣受體CLEC-2產(chǎn)生和調(diào)控的研究
　　C型凝集素受體-2(CLEC-2)是C型凝集素超級族分子中最新被鑒定的一種Ⅱ型跨膜蛋白。已有的研究表明，這種受體能夠識別蛇毒rhodocytin和腫瘤抗原podoplanin，介導(dǎo)血小板聚集、腫瘤逃逸等多種體內(nèi)過程。我們在之前的研究中發(fā)現(xiàn)，小鼠來源的CLEC-2可以被剪切為可溶的形式而釋放到培養(yǎng)上清中。在體內(nèi)，剪切是受體功能調(diào)節(jié)的重要方式；剪

4、切過程產(chǎn)生的可溶性片段，對相關(guān)疾病的早期診斷和預(yù)后有一定的指導(dǎo)意義。因此，在本研究中，我們研究了人CLEC-2產(chǎn)生可溶性片段的可能性。結(jié)果表明，雖然在非刺激情況下，由于頸部區(qū)序列的差異，我們不能檢測到人CLEC-2可溶性片段的產(chǎn)生；但是，當(dāng)用PMA刺激外源性細(xì)胞或血小板，活化PKC通路后，我們會在培養(yǎng)環(huán)境中檢測到可溶性的CLEC-2片段。同時(shí)，我們在研究中發(fā)現(xiàn)，人CLEC-2可溶性片段的產(chǎn)生，依賴于分子的N.糖基化狀態(tài)。人CLEC-2分