白藜蘆醇依次誘導(dǎo)復(fù)制壓力和氧化壓力驅(qū)動(dòng)p53-CXCR2通路介導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞衰老.pdf

1、白藜蘆醇主要存在于葡萄和紅葡萄酒中，也存在于其他植物及果實(shí)中，例如花生，蔓越橘，開心果，藍(lán)莓和越桔?，F(xiàn)在已經(jīng)有這種化合物的純化制劑和膳食補(bǔ)充劑。白藜蘆醇具有廣泛的益處，包括抗衰老，抗血小板聚集，抗氧化，抗炎，降血糖和抗癌。
　　白藜蘆醇抗衰老的作用引起廣泛的關(guān)注。已有研究表明白藜蘆醇的抗氧化性和激活SIRT1的功能可能介導(dǎo)了其抗衰老的作用。從線蟲到哺乳動(dòng)物，都有關(guān)于白藜蘆醇抗衰老作用的報(bào)道。但是近年來(lái)也有研究證明白藜蘆醇可以通過(guò)升

2、高活性氧(ROS)和誘導(dǎo)DNA損傷導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞衰老，所以白藜蘆醇在細(xì)胞水平上的促衰老或抗衰老的作用及其機(jī)制還不完全明確。
　　關(guān)于白藜蘆醇抗氧化和促氧化的作用存在爭(zhēng)議。經(jīng)典的觀點(diǎn)認(rèn)為白藜蘆醇是一個(gè)強(qiáng)大的抗氧化劑，由于其能減少ROS的產(chǎn)生和上調(diào)抗氧化系統(tǒng)的功能，包括還原型谷胱甘肽和超氧化物歧化酶。然而，對(duì)癌細(xì)胞的研究發(fā)現(xiàn)，白藜蘆醇還能破壞細(xì)胞抗氧化系統(tǒng)，導(dǎo)致氧化壓力增加，進(jìn)而抑制細(xì)胞增殖或引起細(xì)胞凋亡。另外，有研究顯示白藜蘆醇通過(guò)誘

3、導(dǎo)ROS的產(chǎn)生導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞的早衰。我們對(duì)白藜蘆醇如何導(dǎo)致這種“氧化二元性”的機(jī)制知之甚少。
　　另外有很多研究表明白藜蘆醇通過(guò)抑制NF-κB和NLRP3發(fā)揮抗炎的作用，預(yù)防很多疾病的發(fā)生。但是也有研究表明白藜蘆醇通過(guò)ERK，p38和Akt信號(hào)通路上調(diào)Ⅱ型膠原和COX-2表達(dá)，具有促炎的作用。白藜蘆醇是如何發(fā)揮促炎作用的及抗炎和促炎之間的決定因素還不清楚。炎癥和氧化應(yīng)激是密切相關(guān)的病理生理過(guò)程，都參與許多慢性疾病的發(fā)生。白藜蘆醇的促

4、氧化和促炎效應(yīng)之間如何關(guān)聯(lián)也不明確。
　　以上研究表明白藜蘆醇具有抗衰老和促衰老、抗氧化和促氧化及抗炎和促炎的作用。我們以U2OS成骨肉瘤細(xì)胞為主要模型，研究了白藜蘆醇誘導(dǎo)細(xì)胞衰老的作用及機(jī)制，得到以下五部分結(jié)果:
　　第一部分白藜蘆醇誘導(dǎo)細(xì)胞S期停滯、DNA損傷應(yīng)答及細(xì)胞的衰老
　　許多研究表明白藜蘆醇具有抗腫瘤的作用。在本部分結(jié)果中我們檢測(cè)了白藜蘆醇對(duì)U2OS細(xì)胞的毒性效應(yīng)。MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示白藜蘆能抑制U2OS細(xì)

5、胞的增殖，并具有濃度依賴性。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)表明經(jīng)白藜蘆醇處理的U2OS細(xì)胞，S期比例數(shù)明顯升高（S期停滯），說(shuō)明存在復(fù)制壓力。我們檢測(cè)了雙鏈斷裂的標(biāo)志物γ-H2AX，結(jié)果發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇導(dǎo)致了DNA損傷，呈劑量依賴性。同時(shí)白藜蘆醇激活了DNA損傷應(yīng)答的主要調(diào)控蛋白ATM，此外復(fù)制壓力的標(biāo)志Chk1磷酸化也升高了。白藜蘆醇長(zhǎng)時(shí)間處理U2OS細(xì)胞能導(dǎo)致U2OS細(xì)胞衰老，而且衰老的細(xì)胞依然是S期比例數(shù)較高。但是只有高濃度白藜蘆醇（≥10μM）能誘

6、導(dǎo)U2OS細(xì)胞S期停滯和細(xì)胞衰老，低濃度的白藜蘆醇沒(méi)有這種作用。為了證明白藜蘆醇誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞衰老這一現(xiàn)象的普遍性，我們用不同濃度的白藜蘆醇處理人正常的成纖維細(xì)胞(NHF)和人的肺癌細(xì)胞(A549)，結(jié)果和U2OS細(xì)胞中的結(jié)果一致，表明白藜蘆誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞衰老的現(xiàn)象是普遍的。此外白藜蘆醇還能部分緩解H2O2誘導(dǎo)的U2OS和NHF的衰老，說(shuō)明在不同的實(shí)驗(yàn)條件下白藜蘆醇誘導(dǎo)衰老或抑制衰老的作用是不同的。
　　第二部分復(fù)制壓力和氧化壓力在白

7、藜蘆醇誘導(dǎo)細(xì)胞衰老中的作用及相互關(guān)系
　　白藜蘆醇被報(bào)道作為核糖核苷酸還原酶的抑制劑起作用，其比羥基脲（一種常用的復(fù)制壓力誘導(dǎo)劑）更有效地抑制小鼠核糖核苷酸還原酶的活性。第一部分的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示白藜蘆醇確實(shí)引起了較明顯的復(fù)制壓力。已經(jīng)有研究證明原癌基因誘導(dǎo)的細(xì)胞衰老是由復(fù)制壓力介導(dǎo)并被外源性的核苷拯救。為檢驗(yàn)白藜蘆醇誘導(dǎo)的細(xì)胞衰老是否由復(fù)制壓力介導(dǎo)，我們檢測(cè)了外源核苷對(duì)細(xì)胞衰老的拯救效應(yīng)。我們用核苷和白藜蘆醇共同處理U2OS細(xì)胞，結(jié)

8、果表明核苷能減少白藜蘆醇導(dǎo)致的DNA損傷，并且5-乙炔基-2’-脫氧尿嘧啶核苷EdU(5-Ethynyl-2’-deoxyuridine)摻入實(shí)驗(yàn)表明核苷能緩解白藜蘆醇導(dǎo)致的復(fù)制壓力。同時(shí)，核苷降低了p-p53的蛋白水平。更重要的是核苷緩解了白藜蘆醇導(dǎo)致的U2OS細(xì)胞的衰老，而且在A549和HT1080另外兩種細(xì)胞中得到一致的結(jié)果。以上結(jié)果表明復(fù)制壓力部分介導(dǎo)了白藜蘆醇誘導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞衰老。
　　有研究表明氧化壓力在白藜蘆醇誘導(dǎo)的結(jié)

9、腸癌和內(nèi)皮細(xì)胞衰老中起很重要的作用。為了驗(yàn)證氧化壓力在白藜蘆醇誘導(dǎo)的U2OS細(xì)胞衰老中的作用，用白藜蘆醇處理U2OS細(xì)胞，流式檢測(cè)ROS水平，結(jié)果白藜蘆醇明顯升高了ROS水平。更重要的是活性氧清除劑N-乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine，NAC)能緩解白藜蘆醇誘導(dǎo)的細(xì)胞衰老。因此，氧化壓力也介導(dǎo)了白藜蘆醇誘導(dǎo)的U2OS細(xì)胞的衰老。既然氧化壓力和復(fù)制壓力都能介導(dǎo)白藜蘆醇誘導(dǎo)的細(xì)胞的衰老，我們下一步研究了這兩種壓力之間的相互關(guān)系

10、及它們介導(dǎo)細(xì)胞衰老的相對(duì)貢獻(xiàn)。從時(shí)間上來(lái)看，白藜蘆醇處理U2OS細(xì)胞12小時(shí)已經(jīng)出現(xiàn)了S期停滯，而ROS水平在白藜蘆醇處理36小時(shí)才檢測(cè)到明顯的升高。此外，NAC和白藜蘆醇共處理U2OS細(xì)胞24小時(shí)并不能緩解其誘導(dǎo)的S期停滯，只有在共處理72小時(shí)的時(shí)候S期停滯才有明顯的緩解。我們?cè)贖T1080細(xì)胞中得到了類似的結(jié)果。以上實(shí)驗(yàn)表明S期停滯的發(fā)生先于ROS水平的升高。
　　之前有研究表明白藜蘆醇通過(guò)上調(diào)NADPH氧化酶NOX1/4來(lái)誘

11、導(dǎo)人內(nèi)皮細(xì)胞的衰老。我們用NOX1/4的特異性抑制劑GKT137831(GKT)與白藜蘆醇共處理，結(jié)果GKT部分緩解了白藜蘆醇誘導(dǎo)的U2OS細(xì)胞的ROS水平的升高。RT-PCR檢測(cè)白藜蘆醇處理不同時(shí)間的NADPH氧化酶的表達(dá)水平，NOX1的mRNA水平在處理48小時(shí)明顯的升高，NOX4水平?jīng)]有升高，NOX2、NOX3、NOX5的水平在處理48小時(shí)有一定的升高。為了明確白藜蘆醇誘導(dǎo)的氧化壓力是否依賴于復(fù)制壓力，我們用血清饑餓法處理NHF細(xì)

12、胞48小時(shí)（此時(shí)大部分細(xì)胞都處于G0/G1期），然后再用白藜蘆醇處理48小時(shí)ROS水平依然升高，表明ROS水平的升高并不依賴S期停滯或復(fù)制壓力。然而NAC能部分緩解S期停滯，表明雖然ROS的升高晚于S期停滯，但是ROS的升高加強(qiáng)并維持了白藜蘆醇導(dǎo)致的S期的停滯。我們也檢測(cè)了存在其他氧化壓力條件下白藜蘆醇對(duì)ROS水平的影響，發(fā)現(xiàn)經(jīng)H2O2處理的U2OS細(xì)胞中，白藜蘆醇能部分降低H2O2導(dǎo)致的ROS水平的升高。在NHF細(xì)胞中的到了類似的結(jié)果

13、，表明白藜蘆醇發(fā)揮促氧化或抗氧化作用取決于實(shí)驗(yàn)條件。
　　第三部分 P53依賴的CXCR2上調(diào)介導(dǎo)細(xì)胞衰老并且具有抗凋亡的作用
　　我們之前的研究證明p53-CXCR2通路在壓力誘導(dǎo)的NHF細(xì)胞和U2OS細(xì)胞衰老中起重要作用。因此我們猜想CXCR2上調(diào)也可能介導(dǎo)了白藜蘆醇誘導(dǎo)U2OS細(xì)胞的衰老。經(jīng)白藜蘆醇處理的U2OS細(xì)胞， CXCR2表達(dá)明顯升高，并具有濃度依賴性和時(shí)間依賴性。但是CXCR2水平的升高在第五天達(dá)到高峰隨后又

14、下降，p21和CXCR2有類似的趨勢(shì)，說(shuō)明衰老一旦形成只需要少量的效應(yīng)蛋白維持即可。另外白藜蘆醇能緩解H2O2導(dǎo)致的CXCR2水平的升高。CXCR2的表達(dá)上調(diào)依賴p53;敲除CXCR2后白藜蘆醇誘導(dǎo)的U2OS細(xì)胞的衰老明顯得到了緩解。以上結(jié)果表明p53-CXCR2通路在白藜蘆醇誘導(dǎo)的細(xì)胞衰老中起到重要作用。
　　我們發(fā)現(xiàn)敲低CXCR2后白藜蘆醇處理組與對(duì)照相比凋亡比例明顯增加，抗凋亡蛋白BCL-2水平也部分下調(diào)。當(dāng)CXCR2被敲低

15、以后，H2O2誘導(dǎo)的U2OS細(xì)胞和NHF細(xì)胞的凋亡比例也明顯增加。以上結(jié)果表明CXCR2具有促衰老抗凋亡的作用。
　　第四部分 NF-kB激活發(fā)揮抗凋亡促衰老作用
　　之前有很多研究表明白藜蘆醇通過(guò)抑制NF-κB和NLRP3的活性發(fā)揮抗炎作用減少體內(nèi)炎癥反應(yīng)。但是也有研究顯示白藜蘆醇可通過(guò)ERK，p38和Akt信號(hào)通路上調(diào)Ⅱ型膠原和COX-2表達(dá)，發(fā)揮促炎的作用。我們發(fā)現(xiàn)50μM白藜蘆醇可以升高U2OS細(xì)胞內(nèi)IL-6、IL-

16、8、IL-1β和COX-2 mRNA水平，說(shuō)明白藜蘆醇可以導(dǎo)致U2OS細(xì)胞內(nèi)炎癥水平升高。我們還發(fā)現(xiàn)NAC可以緩解白藜蘆醇導(dǎo)致的U2OS細(xì)胞內(nèi)IL-8和IL-1β mRNA水平升高，說(shuō)明氧化壓力介導(dǎo)了白藜蘆醇誘導(dǎo)炎癥的產(chǎn)生。另外白藜蘆醇可以誘導(dǎo)p-p65蛋白水平升高，NF-κB抑制劑可以部分緩解白藜蘆醇導(dǎo)致的炎癥因子水平的升高，說(shuō)明白藜蘆醇誘導(dǎo)炎癥產(chǎn)生部分是通過(guò)NF-κB通路介導(dǎo)的。更重要的是NF-κB被抑制后凋亡比例數(shù)明顯的增加，說(shuō)明