Erbin反饋調(diào)控Akt-Skp2-p27通路影響腫瘤細(xì)胞增殖的研究.pdf

1、背景：Erbin（ErbB2 interacting protein），作為ErbB2一種新的結(jié)合蛋白，在2000年被發(fā)現(xiàn)并因此而命名。Erbin屬于LAP蛋白家族的新成員，其結(jié)構(gòu)主要包括：C端的一個(gè)PDZ結(jié)構(gòu)域以及N端的16個(gè)串聯(lián)的LRR結(jié)構(gòu)域。Erbin通過PDZ結(jié)構(gòu)域和ErbB2的C端特異性結(jié)合，引導(dǎo)ErbB2定位在基底膜，維持細(xì)胞的極性；并且作為支架蛋白通過其自身的結(jié)構(gòu)域與其它相應(yīng)蛋白的結(jié)構(gòu)域相互作用進(jìn)而發(fā)揮其功能。Erbin與

2、β-catenin等連環(huán)蛋白相互作用，而進(jìn)入細(xì)胞骨架網(wǎng)絡(luò)，參與上皮細(xì)胞的粘附以及橋粒的形成。近年來研究發(fā)現(xiàn)，一些維持上皮細(xì)胞極性的分子同時(shí)參與細(xì)胞周期的調(diào)控。此外，Erbin作為接頭蛋白，在特定條件下負(fù)性調(diào)控TGF-β/Smads、Ras/Raf-1/ERK以及Nod2/NF-κB細(xì)胞信號(hào)通路。由此可見，Erbin是一個(gè)“多種角色”的極性分子。迄今為止，Erbin還沒有特異性的商品化抗體，我們實(shí)驗(yàn)室早期制備純化了Erbin抗體，做Wes

3、tern blot實(shí)驗(yàn)時(shí)發(fā)現(xiàn)，敲低Erbin通過下調(diào)p21、p27具有促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖與遷移功能，并且在我們隨后的研究中發(fā)現(xiàn)Erbin具有調(diào)節(jié)Akt-Skp2通路的功能。這些線索強(qiáng)烈的提示，Erbin在相關(guān)的癌基因功能中可能作為重要調(diào)控因子。但是Erbin是怎樣調(diào)控Skp2介導(dǎo)的細(xì)胞增殖、遷移與相關(guān)癌基因功能的這些問題還沒有被解決。Skp2由蛋白-蛋白相互作用模塊、F-box序列、“Linker”序列依次連接而成（如亮氨酸重復(fù)結(jié)構(gòu)域），

4、是能與S期激酶CyclinA-CDKI相互作用的蛋白。研究顯示Skp2在不同種類的細(xì)胞中起主導(dǎo)作用的調(diào)控機(jī)制不同，其表達(dá)受轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后水平的雙重調(diào)控。為了抑制細(xì)胞增殖，可以通過調(diào)控Skp2的表達(dá)進(jìn)而增加p27的穩(wěn)定性來實(shí)現(xiàn)。在前列腺癌中的研究顯示,抑癌基因蛋白PTEN的表達(dá)與Skp2的表達(dá)相關(guān),由此推斷抑癌基因PTEN參與Skp2表達(dá)的調(diào)控。PTEN基因在人類癌癥中通常是缺失的，其通過抑制Akt信令發(fā)揮著腫瘤抑制基因的作用。因此對(duì)于因P

5、TEN基因的功能缺損或失活而導(dǎo)致Akt信令解除控制的腫瘤來說，Skp2蛋白或可成為一個(gè)有效的治療標(biāo)靶。Skp2與細(xì)胞周期調(diào)控以及腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和預(yù)后密切相關(guān)，這些都是通過其對(duì)多種靶蛋白的泛素化降解來實(shí)現(xiàn)的。在最近對(duì)Erbin的實(shí)驗(yàn)研究中，我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示Skp2作為Erbin的E3泛素連接酶存在。由此提示，Erbin和Skp2之間可能存在相互作用，并且Skp2介導(dǎo)的細(xì)胞增殖、遷移與相關(guān)癌基因功能可能依賴于Erbin。
　　目的

6、：探討Erbin通過Akt-Skp2-p27信號(hào)通路調(diào)控腫瘤細(xì)胞增殖的分子機(jī)制。
　　方法：⑴利用 Western Blot實(shí)驗(yàn)，以不同的實(shí)驗(yàn)條件在多種細(xì)胞中檢測(cè)Akt-Skp2-p27信號(hào)通路中多種內(nèi)源性或外源性蛋白的表達(dá)情況。⑵應(yīng)用免疫熒光（IF）實(shí)驗(yàn)，以不同的實(shí)驗(yàn)條件，在HeLa細(xì)胞中檢測(cè)Erbin、Skp2在細(xì)胞中的定位變化。⑶經(jīng)免疫共沉淀（Co-IP）實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)HeLa細(xì)胞中，敲低Erbin對(duì)Skp2磷酸化和乙酰化的影響

7、；Erbin與Skp2是否存在相互作用。⑷經(jīng)免疫組化實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)腫瘤組織中Erbin與Skp2的表達(dá)。⑸經(jīng)ATP、EDU、集落形成、劃痕實(shí)驗(yàn)，在HeLa細(xì)胞中檢測(cè)細(xì)胞增殖或遷移。⑹利用體內(nèi)實(shí)驗(yàn)建立移植瘤模型，檢測(cè)Erbin丟失后癌細(xì)胞在體內(nèi)的增殖。
　　結(jié)果：①Western Blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，下調(diào)Erbin通過p27的降解促進(jìn)了內(nèi)源性與外源性Skp2的穩(wěn)定性；Akt-Skp2反饋信號(hào)調(diào)控Erbin表達(dá)。②免疫熒光（IF）實(shí)驗(yàn)檢

8、測(cè)到，Erbin主要定位在細(xì)胞膜和相鄰細(xì)胞的連接處；敲低Erbin增強(qiáng)了Skp2蛋白的穩(wěn)定性，但并未影響 Skp2的定位，未觀察到Akt激活引起Skp2胞質(zhì)定位增加。③經(jīng)免疫共沉淀（Co-IP）實(shí)驗(yàn)檢測(cè)到，敲低Erbin促進(jìn)Skp2的磷酸化和乙?；?；Erbin與Skp2存在相互作用。④經(jīng)免疫組化實(shí)驗(yàn)觀察到，在乳腺癌組織中，Erbin與Skp2的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。⑤經(jīng)ATP、EDU、集落形成、劃痕實(shí)驗(yàn)觀察到，在HeLa細(xì)胞中，Erbin丟失促

9、進(jìn)細(xì)胞增殖，Erbin對(duì)細(xì)胞遷移行為的調(diào)控依賴于Skp2。⑥經(jīng)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，建立移植瘤模型后，發(fā)現(xiàn)Erbin丟失促進(jìn)了癌細(xì)胞在體內(nèi)的增殖。
　　結(jié)論：通過研究，我們證實(shí):Erbin在多種上皮性腫瘤中表達(dá)失調(diào)，Erbin缺失導(dǎo)致細(xì)胞周期S期加快，增殖異常；揭示Erbin參與腫瘤細(xì)胞G1/S轉(zhuǎn)換調(diào)控的分子機(jī)制。Erbin缺失促進(jìn)Akt-Skp2-p27信號(hào)軸激活，而Akt-Skp2活化又促進(jìn)Erbin降解；Erbin既是Skp2的降解底物