NAFLD小鼠Th17通路變化及白藜蘆醇作用機制的初步探討.pdf

1、目的:1、建立非酒精性脂肪性肝病的動物模型。2、初步探討Th17通路在非酒精性脂肪性肝病中的作用及白藜蘆醇對其作用機制的初步研究。
　　方法:本實驗采取隨機-對照的研究方法。將SPF級雄性C57BL/6小鼠按照隨機數(shù)字表進行隨機分組。(1)60只雄性C57BL/6小鼠，6-8周齡，自由攝食AIN93對照飼料7天后，隨機分為Control組、高脂飲食(Highfat diet，HFD)組及西方飲食(Western diet，WD)組

2、，Control組16只，HFD組及WD組分別22只。分別給予對照飼料、高脂飼料、高脂飼料加高糖飲用水(42g/L)，造模時間33周。從WD組中隨機抽取12只小鼠，每組6只，分別給予白藜蘆醇(resveratrol，Res)及羧甲基纖維素(carboxymethylcellulose sodium，CMC)45mg/kg/day灌胃，繼續(xù)喂養(yǎng)6周后處死小鼠。(2)定期觀察小鼠的進食、精神狀態(tài)及毛發(fā)光澤度等，每周測量小鼠體重并記錄。(3)

3、觀察各組小鼠肝臟外形變化，記錄肝重，計算并比較肝重指數(shù)。(4)應(yīng)用苦味酸-天狼猩紅及蘇木素-伊紅(hematoxylinand eosin，HE)染色觀察肝組織病理學(xué)的改變。(5)檢測血清白細胞介素-17(interleukin-17，IL-17)、甘油三酯（Triglyceride，TG）、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（Aspartate aminotransferase，AST）及丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(Alanineaminotransferas

4、e，ALT)的變化情況。(6)應(yīng)用實時熒光定量PCR(Real-timefluorescent quantitation PCR, Real-time qPCR)方法檢測肝組織中TGF-βmRNA、IL-22 mRNA、RORγt mRNA及IL-17A mRNA的表達情況。(7)提取肝、脾組織中的淋巴細胞，行流式細胞學(xué)檢測，了解肝、脾組織中CD4/CD8比值及CD4+T細胞IL-17、RORγ t的表達情況。(8)應(yīng)用免疫組織化學(xué)的方

5、法檢測肝臟組織中α-SMA的表達情況。
　　結(jié)果:(1) HE及苦味酸-天狼猩紅染色顯示，Control組肝臟肝細胞大小及排列正常;HFD組和WD組形成非酒精性脂肪性肝炎及肝纖維化，造模成功;與WD+CMC組比較，WD+Res組肝纖維化程度明顯減輕(P＜0.05)。(2)與Control組比較，HFD組和WD組血清ALT、AST及TG明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);與HFD組比較，WD組ALT、AST升高，差異有統(tǒng)計學(xué)

6、意義(P＜0.05)，TG降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);與WD+CMC組比較，WD+Res組血清ALT、AST及TG均明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。(3)Real-time QPCR:與Control組比較，WD和HFD組TGF-β、IL-22及RORtmRNA表達增高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，HFD組IL-17 mRNA表達無明顯差異(P＞0.05);與HFD組比較，WD組TGF-β、IL-22、RO

7、Rγt及IL-17 mRNA表達增高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);與WD+CMC組比較，WD+Res組TGF-β、IL-22、RORγt及IL-17 mRNA表達均明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。(4)血清IL-17:與Control組比較，HFD組及WD組明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);WD組較HFD組升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);與WD+CMC組比較，WD+Res組IL-17表達量明顯降低，差

8、異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。(5)流式細胞學(xué)結(jié)果:肝臟:與Control組及HFD組比較，WD組CD4/CD8比值升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，Control組與HFD組比較CD4/CD8比值無明顯差異(P＞0.05);與Control組比較，HFD組及WD組CD4+T RORγ t表達量升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，且WD組較HFD組升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。與WD+CMC組比較，WD+Res組C

9、D4/CD8比值及CD4+T RORγt表達量明顯下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05); CD4+T IL-17的表達量在治療前后各組間均無明顯表達。脾臟:CD4/CD8比值、CD4+T RORγt及CD4+T IL-17表達量在治療前后均無明顯變化。(6)免疫組化:α-SMA:與Control組比較，HFD組及WD組α-SMA表達量增高(P＜0.05)，且WD組明顯高于HFD組(P＜0.05);同WD+CMC組比較，WD+Res組表

10、達下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。
　　結(jié)論:
　　1、通過采用經(jīng)典的西方飲食，成功建立了NASH相關(guān)肝纖維化小鼠模型。
　　2、模型組血清及組織中IL-17表達升高，提示Th17通路在NAFLD進展中發(fā)揮了重要作用。
　　3、果糖在NASH相關(guān)肝纖維化的形成中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。
　　4、α-SMA、TGF-β、IL-22、IL-17及RORγt在NAFLD炎癥反應(yīng)及肝纖維化中均發(fā)揮了重要作用。