腸肝軸在NAFLD小鼠發(fā)病中的作用及白藜蘆醇對其作用機(jī)制的初步探討.pdf

1、目的：
　　1.動(dòng)態(tài)觀察非酒精性脂肪性肝?。∟on-alcoholic fatty liver disease, NAFLD）小鼠肝臟脂肪變及腸道黏膜屏障功能的變化，初步探討腸肝軸在NAFLD中的作用；
　　2.予白藜蘆醇灌胃進(jìn)行干預(yù)，觀察內(nèi)毒素水平、腸道菌群、腸黏膜屏障和炎癥的變化，初步探討該藥物是否通過腸肝軸在NAFLD中發(fā)揮治療作用。
　　方法：
　　1.按照隨機(jī)數(shù)字表將SPF級雄性C57BL/6小鼠隨機(jī)分

2、組。48只雄性C57BL/6小鼠，6-8周齡，自由攝食AIN93對照飼料7天后，按照1:1比例隨機(jī)分為正常對照組（NG, n=24）、模型組（MG, n=24），分別給予對照飼料加正常飲水、高脂飼料加高糖飲用水（42g/L）即西方飲食（Western diet），每組分為4、10、18、24周4個(gè)時(shí)相點(diǎn)，每個(gè)時(shí)相點(diǎn)隨機(jī)分配6只動(dòng)物，正常對照組分別記為NG4、NG10、NG18、NG24；模型組分別記為MG4、MG10、MG18、MG24

3、。另取18只雄性C57BL/6小鼠，6-8周齡，自由攝食AIN93對照飼料7天后，按照1:2比例隨機(jī)分為正常對照組（NG, n=6）、模型組（MG, n=12），分別給予對照飼料加正常飲水、高脂飼料加高糖飲用水（42g/L），造模24周后，正常對照組6只小鼠給予羧甲基纖維素（Carboxymethylcellulose sodium, CMC）45mg/kg/day灌胃，標(biāo)記為NG+CMC組，模型組12只小鼠，隨機(jī)分為2組，每組6只，分

4、別給予白藜蘆醇（Resveratrol, Res）及CMC45mg/kg/day灌胃，分別標(biāo)記為MG+Res組、MG+CMC組；6周后處死小鼠，并留取標(biāo)本行相應(yīng)檢測。
　　2.定期觀察小鼠的進(jìn)食、精神狀態(tài)及毛發(fā)光澤度等，每周測量小鼠體重并記錄。
　　3.觀察各組小鼠肝臟外形變化，記錄肝重，計(jì)算并比較肝重指數(shù)。4應(yīng)用蘇木素-伊紅（Hematoxylin and eosin, HE）染色觀察肝組織及末端回腸黏膜病理學(xué)的改變。

5、r>　　5.檢測各組血清甘油三酯（Triglyceride, TG）、血清總膽固醇（Total Cholesterol, TC）、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（Aspartate aminotransferase, AST）及丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（Alanine aminotransferase, ALT）的變化情況，采用鱟試劑法測定內(nèi)毒素水平。
　　6.應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（Real-time fluorescent quantitatio

6、n PCR, Real-time qPCR）方法檢測各組小鼠肝組織中腫瘤壞死因子-α（Tumor necrosis factor, TNF-α）mRNA及小鼠回腸組織中Occludin mRNA、TNF-αmRNA的表達(dá)情況。
　　7.應(yīng)用蛋白免疫印跡（Western Blot）方法檢測各組肝臟組織中TNF-α蛋白及小鼠回腸組織中Occludin、TNF-α蛋白的表達(dá)情況。
　　8.應(yīng)用16s rRNA宏基因組測序的方法了解

7、白藜蘆醇干預(yù)后小鼠腸道菌群的變化情況。
　　結(jié)果：
　　1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的體重、肝重指數(shù)比較
　　1.1.與NG4組比較，MG4組小鼠體重?zé)o顯著性差異（P＞0.05）；與NG4組比較， MG4組小鼠肝重指數(shù)稍增加（P＜0.05）。
　　1.2.MG10、MG18、MG24組分別較同一時(shí)期 NG10、NG18、NG24組體重及肝重指數(shù)顯著升高（P＜0.05）。
　　1.3.MG+Res組較MG+CMC組小鼠體重、

8、肝重指數(shù)下降（P＜0.05），但仍明顯高于NG+CMC組（P＜0.05）。
　　2.肝臟組織病理學(xué)改變
　　HE染色顯示，正常對照組各觀察時(shí)間點(diǎn)小鼠肝臟肝小葉結(jié)構(gòu)完整且排列規(guī)則，肝細(xì)胞形態(tài)正常，未見脂滴及炎性細(xì)胞；MG4組小鼠肝臟中少數(shù)肝細(xì)胞胞質(zhì)疏松及少量脂滴沉積，肝細(xì)胞脂肪變比例＜5％；MG10組肝臟中肝細(xì)胞部分胞質(zhì)疏松呈空泡狀及較多的脂滴沉積，肝細(xì)胞脂肪變比例約為30%-50%；MG18組肝臟大部分肝細(xì)胞內(nèi)充滿脂滴，肝細(xì)

9、胞脂肪變比例約為50%-80%；MG24組肝臟廣泛彌漫性肝細(xì)胞脂肪變，脂質(zhì)內(nèi)充滿大量較大的脂肪空泡，肝細(xì)胞脂肪變比例＞80%。MG+Res組較MG+CMC組肝脂肪變程度明顯減輕。
　　3.回腸組織病理學(xué)改變
　　對照組各觀察時(shí)間點(diǎn)小鼠末端回腸黏膜結(jié)構(gòu)完整，絨毛排列整齊規(guī)則，未見缺損；模型組中 MG4組小鼠回腸組織病理與正常對照組比較無明顯區(qū)別；MG10組小鼠回腸組織絨毛排列疏松紊亂；MG18、MG24組小鼠回腸組織部分絨毛萎

10、縮缺損斷裂，上皮層與固有層部分出現(xiàn)分離，病變程度逐漸加重。應(yīng)用白藜蘆醇治療后， MG+Res組腸道黏膜損傷情況較MG+CMC組稍減輕。
　　4.血清ALT、AST、TG、TC、LPS
　　4.1.MG4、MG10、MG18、MG24組分別較同一時(shí)期NG4、NG10、NG18、NG24組血清ALT、AST及內(nèi)毒素水平顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；MG4組與 NG4組相比，血清 TG、TC無明顯區(qū)別（P＞0.05）

11、；MG10、MG18、MG24組分別較同一時(shí)期NG10、NG18、NG24組血清TG、TC顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。
　　4.2.Res治療之后，MG+Res組較MG+CMC組小鼠ALT、AST、TG、TC和內(nèi)毒素水平顯著降低（P＜0.05），但仍顯著高于NG+CMC組（P＜0.05）。5 TNF-αmRNA與蛋白在肝臟組織的表達(dá)情況
　　與NG24組比較，MG24組肝臟TNF-α mRNA與蛋白表達(dá)顯著增

12、高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。MG+Res組較MG+CMC組小鼠肝臟TNF-αmRNA與蛋白表達(dá)顯著降低（P＜0.05），但仍顯著高于NG+CMC組（P＜0.05）。
　　6.TNF-α、Occludin mRNA與蛋白在回腸組織的表達(dá)情況
　　6.1.與NG24組比較，MG24組腸道TNF-αmRNA與蛋白表達(dá)顯著增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。MG+Res組較MG+CMC組小鼠腸道TNF-αmRNA與蛋白

13、表達(dá)顯著降低（P＜0.05），但仍顯著高于NG+CMC組（P＜0.05）。
　　6.2.與NG24組比較，MG24組腸道Occludin mRNA與蛋白表達(dá)顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。MG+Res組較 MG+CMC組小鼠腸道Occludin mRNA與蛋白表達(dá)顯著增高（P＜0.05），但仍明顯低于NG+CMC組（P＜0.05）。
　　7.16s rRNA宏基因組分析結(jié)果
　　7.1.Res治療之前：MG

14、組較NG組增多的有：厚壁菌門（Firmicutes）、放線菌門（Actinobacteria）、疣微菌門（Verrucomicrobia）和變形菌門（Proteobacteria），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；MG組較NG組減少的有擬桿菌（Bacteroidetes），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。
　　7.2.Res治療之后：MG+Res組較 MG+CMC組增多的有擬桿菌（Bacteroidetes），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義

15、（P＜0.05）。MG+Res組較MG+CMC組減少的有：厚壁菌門（Firmicutes）、放線菌門（Actinobacteria）、疣微菌門（Verrucomicrobia）和變形菌門（Proteobacteria），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。
　　結(jié)論：
　　1.通過采用經(jīng)典的西方飲食，成功建立了 NAFLD小鼠模型，證實(shí)NAFLD小鼠早期即存在腸源性內(nèi)毒素血癥。
　　2.NAFLD小鼠腸黏膜上皮緊密連接O