膠質(zhì)瘤間質(zhì)-上皮轉(zhuǎn)化的傾向及白藜蘆醇對(duì)其的調(diào)節(jié)作用.pdf

1、目的:
　　膠質(zhì)瘤(glioma)是最為常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)惡性腫瘤,具有較高的侵襲性,邊界不清晰,故單純的手術(shù)切除無法達(dá)到治療效果。大量的研究表明,上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)以及與其逆反的間質(zhì)-上皮轉(zhuǎn)化（mesenchymal-to-epithelial transition,MET）與腫瘤的發(fā)生發(fā)展之間存在一定的聯(lián)系。EMT能夠促進(jìn)腫瘤的遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移與異位侵襲,而ME

2、T能夠促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖與分化。白藜蘆醇(resveratrol,Res)是具有抗癌作用的天然多酚類化合物,對(duì)膠質(zhì)瘤具有一定的抗腫瘤作用。本實(shí)驗(yàn)室前期的蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)的分析表明,膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系經(jīng)白藜蘆醇處理后,角蛋白17(KRT17)的表達(dá)水平明顯下調(diào)。因KRT17是上皮性腫瘤的標(biāo)志物,說明白藜蘆醇能夠降低膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中上皮特性分子的異常高表達(dá)。因此,本實(shí)驗(yàn)旨在證明人膠質(zhì)瘤中具有間質(zhì)-上皮轉(zhuǎn)化的傾向,并分析膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系中白藜蘆

3、醇對(duì)間質(zhì)-上皮轉(zhuǎn)化的調(diào)節(jié)作用。具體研究內(nèi)容如下:
　　1.檢測KRT17、E-cadherin、N-cadherin及β-catenin在膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)情況,并分析它們與腫瘤分級(jí)之間的相關(guān)性;
　　2.分析KRT17與E-cadherin之間的相關(guān)性;
　　3.檢測膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系LN428、LN18及U251對(duì)白藜蘆醇的敏感性;
　　4.檢測白藜蘆醇處理前后,LN428、LN18及U251中KRT17、E

4、-cadherin、N-cadherin及β-catenin中的表達(dá)情況;
　　5.檢測β-catenin在LN428、LN18及U251中的核易位情況及白藜蘆醇對(duì)其的作用;
　　6.揭示膠質(zhì)瘤組織中MET的傾向,以及白藜蘆醇對(duì)這一傾向的逆轉(zhuǎn)作用與意義。
　　方法:
　　利用石蠟組織微陣列技術(shù)及免疫組織化學(xué)染色(IHC)檢測KRT17、E-cadherin、N-cadherin及β-catenin在95例人膠質(zhì)瘤

5、組織中的表達(dá)情況,并利用SPSS18對(duì)它們與腫瘤分級(jí)之間的關(guān)系以及KRT17與E-cadherin、β-catenin之間的相關(guān)性進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析;采用H-E染色和MTT法檢測膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系LN428、LN18及U251對(duì)于白藜蘆醇的藥物敏感性;通過RT-PCR、免疫細(xì)胞化學(xué)(ICC)、Western-blotting方法檢測,100μM白藜蘆醇處理48小時(shí)前后,KRT17、E-cadherin、N-cadherin及β-cateni

6、n的表達(dá)情況;采用免疫熒光技術(shù)(IF)檢測β-catenin在LN428、LN18及U251中的核易位情況及白藜蘆醇對(duì)其的影響。
　　結(jié)果:
　　1.膠質(zhì)瘤組織中KRT17、E-cadherin、N-cadherin及β-catenin的IHC檢測:
　　(1)陽性率比較:KRT17、E-cadherin、N-cadherin及β-catenin在膠質(zhì)瘤組織中的陽性率分別為67.8％、27.8％、100％、92.2％,

7、瘤旁組織中的陽性率分別為0％、20％、100％、60％,其中KRT17和β-catenin在膠質(zhì)瘤中的陽性率高于瘤旁組織。
　　(2)與腫瘤分級(jí)的相關(guān)性分析:β-catenin的表達(dá)水平與膠質(zhì)瘤分級(jí)間呈正相關(guān)(β=0.045,r=0.212);KRT17(p=0.493,r=0.028)、E-cadherin(p=0.474,r=-0.017)、N-cadherin(p=0.499,r=0.014)與膠質(zhì)瘤分級(jí)間的相關(guān)性分析均不具

8、有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　(3) KRT17與E-cadherin的表達(dá)水平之間呈正相關(guān),具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p=0.023,r=0.232)。
　　2.白藜蘆醇敏感性的檢測:HE染色和MTT法的結(jié)果顯示,LN428在經(jīng)過白藜蘆醇處理后,細(xì)胞數(shù)目基本不變,細(xì)胞形態(tài)無明顯變化,具有耐藥性;LN18加藥后,細(xì)胞數(shù)目略有減少,形態(tài)變化不明顯,不具有絕對(duì)的敏感性;U251加藥后,細(xì)胞數(shù)目大量減少,形態(tài)發(fā)生明顯變化,對(duì)于白藜蘆醇十分敏感。

9、
　　3.MET相關(guān)分子表達(dá)情況的檢測:
　　(1)細(xì)胞骨架蛋白KRT17:LN428中呈強(qiáng)陽性表達(dá),經(jīng)白藜蘆醇處理后,其PCR、ICC及Western的結(jié)果均顯示表達(dá)水平明顯下調(diào);在LN18和U251中呈近陰性表達(dá)。
　　(2)上皮標(biāo)志物E-cadherin:LN428中呈陽性表達(dá),加藥后表達(dá)水平略有下調(diào);LN18的PCR結(jié)果顯示其有表達(dá),但I(xiàn)CC及Western顯示陰性表達(dá);U251中呈陰性表達(dá)。
　　(3)

10、間質(zhì)標(biāo)志物N-cadherin:在LN428、LN18及U251中都呈陽性表達(dá),LN428中表達(dá)水平下調(diào);LN18中表達(dá)基本無差異;U251的PCR顯示無差異,ICC及Western顯示表達(dá)略有下調(diào)。
　　(4)連環(huán)蛋白β-catenin:LN428中呈陽性表達(dá),加藥后PCR顯示不變,ICC及Western顯示表達(dá)水平下調(diào);LN18及U251中弱表達(dá),無明顯差異。
　　4.IF檢測結(jié)果顯示,LN428中發(fā)生了β-cateni

11、n的核易位,在經(jīng)過白藜蘆醇處理后其核內(nèi)β-catenin的表達(dá)水平下調(diào)。
　　結(jié)論：
　　1.KRT17、E-cadherin在膠質(zhì)瘤組織中的陽性率分別為67.8％、27.8％,高于瘤旁組織中的陽性率0％、20％;這些上皮標(biāo)志分子表達(dá)的增強(qiáng),提示膠質(zhì)瘤中具有間質(zhì)-上皮轉(zhuǎn)化的傾向。
　　2.β-catenin的表達(dá)水平與膠質(zhì)瘤分級(jí)間呈正相關(guān)(p=0.045,r=0.212),說明隨著腫瘤惡性程度的增加,其增殖的能力也隨之

12、增強(qiáng);KRT17與E-cadherin的表達(dá)之間呈正相關(guān)(p=0.023,r=0.212),提示這兩種上皮標(biāo)志物之間具有一定的聯(lián)系。
　　3.經(jīng)白藜蘆醇處理后,膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系中KRT17、E-cadherin的表達(dá)水平降低,說明其上皮特性減弱,向間質(zhì)特性轉(zhuǎn)化;N-cadherin及核易位的β-catenin的表達(dá)水平降低,說明白藜蘆醇在逆轉(zhuǎn)其間質(zhì)-上皮轉(zhuǎn)化的同時(shí),誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡,并抑制其增殖,從而發(fā)揮抗癌效應(yīng)。
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