MORN4及NR4A2在缺血心肌凋亡中的作用及分子機(jī)制研究.pdf

1、研究背景和目的：
　　急性心肌梗死等缺血性心臟病是致死率最高的疾病之一，其發(fā)病機(jī)理是冠狀動脈循環(huán)受阻導(dǎo)致供應(yīng)到心臟的血液減少，心肌細(xì)胞由于營養(yǎng)缺乏而發(fā)生大量死亡，對心室造成不可逆的損傷。因此抑制缺血引起的心肌細(xì)胞凋亡，對于缺血性心臟疾病的治療非常重要。自噬增加是缺血心肌的另一重要病理現(xiàn)象，通過清除細(xì)胞內(nèi)損傷細(xì)胞器或長壽蛋白來維持細(xì)胞生存所需基本能量，因此，適度的自噬對于細(xì)胞的存活是有益的，但過度的自噬可能會引發(fā)細(xì)胞死亡。自噬和凋亡

2、互相聯(lián)系形成復(fù)雜的關(guān)系網(wǎng)絡(luò)，影響自噬與凋亡的分子機(jī)制需要進(jìn)一步研究。
　　我們前期的研究發(fā)現(xiàn)鞘氨醇磷酸膽堿(Sphingosylphosphorylcholine，SPC)能通過自噬抑制缺血心肌細(xì)胞的凋亡。SPC是一種生物活性鞘脂類，可以作為有效工具發(fā)現(xiàn)心肌細(xì)胞自噬和凋亡關(guān)聯(lián)的新因子。我們利用體外心肌細(xì)胞缺血模型結(jié)合基因芯片技術(shù)研究了SPC調(diào)控的基因，發(fā)現(xiàn)MORN4及NR4A2受到SPC的調(diào)控，可能是調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞自噬和凋亡的重要因

3、子。
　　MORN4(the membrane occupation and recognition nexus repeats4 times)是包含4個MORN motif的蛋白。MORN motif廣泛存在于動物、植物和原生生物的蛋白中，數(shù)量從2-17不等，但對其功能所知甚少。研究發(fā)現(xiàn)MORN motif與蛋白的膜定位有關(guān)，如phosphatidylinositol phosphate kinase(PIPK)上的MORNmo

4、tif可將其定位在細(xì)胞膜上;而與葉綠體分裂相關(guān)的蛋白accumulation andreplication of chloroplast(ARC3)通過MORN motif定位到類囊體膜上。目前有關(guān)MORN4的報道更少，僅限于參與果蠅光敏反應(yīng)的研究，MORN4是否在缺血心肌中發(fā)揮功能還不清楚。
　　NR4A2(Nuclear receptor subfamily4,group A, member2)也叫Nurr1，與NR4A1，N

5、R4A3組成NR4A孤核受體家族。NR4A家族屬即早期反應(yīng)的轉(zhuǎn)錄因子，能夠迅速對環(huán)境的改變做出反應(yīng)。已有研究表明，NR4A2參與到腫瘤，肥胖，糖尿病，特別是神經(jīng)類疾病的發(fā)生中，但是是否參與缺血性心臟病目前還不清楚。NR4A2在疾病中的功能與其調(diào)控分化，凋亡，遷移，增殖等有關(guān)，根據(jù)芯片結(jié)果我們推測NR4A2可能是參與心肌細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵因子，目前，NR4A1參與細(xì)胞凋亡的研究已有較多報道，但是NR4A2與NR4A1在DNA結(jié)合區(qū)域和配體結(jié)合

6、區(qū)域的不同使得兩者功能不同，有關(guān)NR4A2的報道主要集中在肺癌細(xì)胞中，如:NR4A2在肺癌細(xì)胞中通過與p53結(jié)合抑制Bax的表達(dá)，抑制細(xì)胞凋亡。但是NR4A2是否參與心肌細(xì)胞的凋亡尚未見報道。
　　基于以上問題，本論文研究了MORN4及NR4A2在缺血心肌細(xì)胞自噬與凋亡中的作用，并進(jìn)一步闡明了相關(guān)的作用機(jī)制。本論文的研究結(jié)果為缺血性心臟病的治療提供了新的藥物作用靶點(diǎn)。
　　研究結(jié)果：
　　1.SPC通過JNK/MORN

7、4/MFN2促進(jìn)的自噬抑制缺血心肌細(xì)胞的凋亡
　　1.1.SPC上調(diào)MORN4的表達(dá)
　　去血清處理H9c2心肌細(xì)胞用以模擬心肌缺血的體內(nèi)環(huán)境，并加入SPC檢測MORN4的變化。Western blot及免疫熒光顯示5μM SPC明顯上調(diào)MORN4的蛋白水平。熒光定量PCR驗(yàn)證了5μM SPC上調(diào)MORN4的RNA水平。因此，SPC能夠上調(diào)MORN4的表達(dá)。
　　1.2.MORN4在缺血心肌細(xì)胞和心梗心臟中的表達(dá)升高<

8、br>　　為了明確MORN4是否參與心肌細(xì)胞缺血過程，我們檢測了MORN4在缺血心肌中的表達(dá)。Western blot顯示當(dāng)缺血超過4h時，伴隨著凋亡maker PARP和caspase3切割的增加，MORN4的表達(dá)也顯著上調(diào)。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)利用急性心梗模型進(jìn)行驗(yàn)證，western blot結(jié)果表明，與對照組相比，心梗模型中心臟組織的PARP和caspase3的切割明顯高于對照組，同時MORN4的表達(dá)明顯升高。QPCR結(jié)果與蛋白水平變化一致。

9、
　　1.3.干擾MORN4促進(jìn)H9c2細(xì)胞和原代心肌細(xì)胞的凋亡
　　為了明確MORN4在缺血心肌細(xì)胞凋亡中的作用，我們利用MORN4的干擾RNA抑制MORN4的表達(dá)。瓊脂糖凝膠電泳，QPCR和免疫熒光結(jié)果表明80 nM的siRNA明顯降低MORN4的表達(dá)。Western blot結(jié)果表明MORN4敲減后H9c2細(xì)胞和原代心肌細(xì)胞凋亡marker PARP與caspase3的切割都增加。TUNEL染色結(jié)果表明干擾MORN4后

10、缺血導(dǎo)致的心肌細(xì)胞的凋亡進(jìn)一步加劇。因此，干擾MORN4促進(jìn)心肌細(xì)胞凋亡。
　　1.4.干擾MORN4抑制H9c2細(xì)胞和原代心肌細(xì)胞的自噬流
　　我們進(jìn)而利用MORN4的干擾RNA探究MORN4在缺血心肌自噬中的作用。干擾MORN4后，western blot結(jié)果顯示心肌細(xì)胞LC3-Ⅱ蛋白水平明顯升高;熒光顯微鏡下觀察到轉(zhuǎn)入EGFP-LC3的心肌細(xì)胞中LC3點(diǎn)狀聚集明顯增多。為了分析LC3-Ⅱ增多的原因，我們利用了自噬起始的

11、抑制劑3-methyladenine(3MA)及自噬流的阻斷劑bafilomycin A1(Baf A1)。由于3MA和BafA1均沒有影響LC3-Ⅱ的蛋白水平，表明MORN4的siRNA通過阻斷缺血心肌細(xì)胞的自噬流導(dǎo)致了LC3-Ⅱ增多。
　　1.5.干擾MORN4通過阻斷自噬流促進(jìn)心肌細(xì)胞凋亡
　　我們利用自噬流的阻斷劑Baf A1和自噬促進(jìn)劑Rapamycin確認(rèn)MORN4敲減導(dǎo)致的自噬流阻斷與細(xì)胞凋亡的關(guān)系。Weste

12、rn blot結(jié)果顯示Rapamycin促進(jìn)自噬后抑制了MORN4敲減導(dǎo)致的心肌細(xì)胞凋亡，表明MORN4敲減導(dǎo)致的心肌細(xì)胞凋亡與自噬抑制有關(guān);而Baf A1阻斷自噬流并沒有進(jìn)一步影響心肌細(xì)胞凋亡的變化，表明MORN4敲減通過阻斷自噬流進(jìn)而抑制自噬促進(jìn)心肌細(xì)胞凋亡。
　　1.6.SPC通過MORN4抑制缺血心肌細(xì)胞的凋亡
　　我們接下來利用MORN4的干擾RNA檢測SPC是否通過MORN4保護(hù)心肌細(xì)胞凋亡。Western bl

13、ot結(jié)果顯示干擾MORN4后逆轉(zhuǎn)了SPC降低的PARP和caspase3的切割。因此，SPC通過MORN4保護(hù)心肌細(xì)胞凋亡。
　　1.7.SPC通過MORN4與mitofusion2(MFN2)的相互作用促進(jìn)自噬
　　Western blot結(jié)果表明缺血時MFN2的表達(dá)升高，為了明確MORN4是否通過MFN2調(diào)節(jié)自噬，首先檢測了MORN4對MFN2的影響，結(jié)果表明干擾MORN4抑制，而過表達(dá)MORN4促進(jìn)MFN2的表達(dá)。Co

14、-IP結(jié)果顯示MORN4可以與MFN2直接結(jié)合。Western blot結(jié)果表明，SPC可以逆轉(zhuǎn)MORN4敲減導(dǎo)致的MFN2的降低。因此，SPC可能通過MORN4與mitofusion2(MFN2)的相互作用促進(jìn)自噬。
　　1.8 SPC通過JNK促進(jìn)MORN4表達(dá)，而MORN4負(fù)反饋調(diào)節(jié)JNK。
　　SPC可通過JNK調(diào)節(jié)自噬，我們探究了JNK與MORN4之間的關(guān)系。免疫熒光結(jié)果顯示JNK磷酸化的抑制劑SP600125降低

15、MORN4的表達(dá)，而western結(jié)果表明干擾MORN4后磷酸化的JNK升高。因此SPC通過磷酸化JNK促進(jìn)MORN4的表達(dá)，而MORN4對JNK有負(fù)反饋調(diào)節(jié)。
　　2.NR4A2通過促進(jìn)自噬抑制缺血心肌細(xì)胞的凋亡
　　2.1.NR4A2在缺血心肌細(xì)胞中的表達(dá)升高
　　我們利用QPCR，western blot及免疫熒光檢測了NR4A2在缺血心肌細(xì)胞中的變化，發(fā)現(xiàn)NR4A2在去除血清的H9c2細(xì)胞中，mRNA水平和蛋白

16、水平都有明顯升高。
　　2.2.NR4A2抑制缺血H9c2細(xì)胞和原代心肌細(xì)胞的凋亡
　　為了探究NR4A2在缺血引發(fā)的心肌細(xì)胞凋亡中的作用，我們使用了NR4A2干擾RNA和NR4A2過表達(dá)質(zhì)粒，并利用QPCR及western blot對效果進(jìn)行了驗(yàn)證。NR4A2敲減后，PARP和caspase3的切割明顯高于對照組， TUNEL染色發(fā)現(xiàn)NR4A2敲減后，凋亡細(xì)胞明顯增多;而過表達(dá)NR4A2能夠減少缺血心肌細(xì)胞PARP和cas

17、pase3的切割。因此，NR4A2抑制缺血心肌細(xì)胞的凋亡。
　　2.3.干擾NR4A2抑制心肌細(xì)胞的自噬流
　　為了明確NR4A2是否影響心肌細(xì)胞的自噬，我們利用NR4A2的siRNA抑制NR4A2的表達(dá)，western blot結(jié)果顯示NR4A2敲減能上調(diào)LC3-Ⅱ水平;轉(zhuǎn)入pEGFP-LC3之后，免疫熒光結(jié)果表明NR4A2敲減使LC3點(diǎn)狀聚集增加，NR4A2過表達(dá)則使LC3-Ⅱ明顯降低。我們進(jìn)一步利用自噬流的阻斷劑Baf

18、 A1和NH4Cl以及自噬起始的抑制劑3MA驗(yàn)證NR4A2的作用，western blot結(jié)果表明NR4A2敲減抑制了缺血心肌細(xì)胞的自噬流。
　　2.4.干擾NR4A2通過抑制自噬流促進(jìn)缺血H9c2細(xì)胞的凋亡
　　為了明確NR4A2調(diào)節(jié)的自噬與凋亡是否相關(guān)，我們使用了自噬的抑制劑BafA1，western blot顯示PARP和caspase3切割沒有進(jìn)一步升高;而自噬促進(jìn)劑Rapamycin加入后心肌細(xì)胞的PARP和cas

19、pase3切割明顯被抑制。因此，干擾NR4A2通過阻斷自噬流促進(jìn)心肌細(xì)胞的凋亡。
　　2.5.NR4A2通過p53/Bax抑制H9c2心肌細(xì)胞凋亡。
　　為了檢測NR4A2在H9c2心肌細(xì)胞中是否通過p53/Bax抑制心肌細(xì)胞凋亡，我們將NR4A2進(jìn)行干擾或過表達(dá)，western blot結(jié)果表明NR4A2敲減后p53和Bax的表達(dá)都升高，而NR4A2過表達(dá)后，p53和Bax的表達(dá)都降低。co-IP結(jié)果顯示p53能與NR4A

20、2相結(jié)合，表明NR4A2通過p53/Bax抑制心肌細(xì)胞凋亡。免疫熒光結(jié)果表明NR4A2抑制了p53在細(xì)胞核的定位，由于p53在細(xì)胞核中促進(jìn)細(xì)胞自噬，表明NR4A2可能也通過p53調(diào)節(jié)自噬。
　　2.6.MiR-212-3p是NR4A2/p53/Bax的上游因子
　　QPCR結(jié)果表明miR-212-3p在缺血時表達(dá)降低，而且軟件預(yù)測發(fā)現(xiàn)MiR-212-3p能夠靶向NR4A2，因此MiR-212-3p可能是靶向NR4A2的上游因

21、子。QPCR和western blot結(jié)果表明，MiR-212-3p的inhibitor上調(diào)NR4A2 RNA和蛋白水平的表達(dá)，而mimics則抑制其表達(dá)，表明miR-212-3p能夠調(diào)節(jié)NR4A2;雙熒光素報告基因?qū)嶒?yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證miR-212-3p直接靶向NR4A2。而且，MiR-212-3p的inhibitor抑制缺血心肌細(xì)胞凋亡，抑制p53和Bax的水平，與NR4A2的作用一致。因此，miR-212-3p是NR4A2/p53/Ba