血管免疫母細(xì)胞性T細(xì)胞淋巴瘤中NR4A3基因5’UTR區(qū)域甲基化狀態(tài)的研究.pdf

1、背景：
　　血管免疫母細(xì)胞性T細(xì)胞淋巴瘤(angioimmunoblastic T-celllymphoma，AITL)是外周T細(xì)胞淋巴瘤(Peripheral T-cell lymphoma，PTCL)的一種常見亞型。AITL的起因和機(jī)理的研究還不明確，而且對(duì)于其治療仍未達(dá)到共識(shí)。對(duì)于AITL的形成，遺傳學(xué)和表觀遺傳學(xué)機(jī)制都對(duì)AITL形成和發(fā)展起到了作用?；騈R4A3屬于NR4A家族，參與細(xì)胞周期、凋亡、炎癥、代謝等過程?，F(xiàn)在

2、已經(jīng)有證實(shí)在許多腫瘤中起到抑制作用，特別是在血液系統(tǒng)腫瘤中。本實(shí)驗(yàn)主要研究基因NR4A3的5'UTR區(qū)域甲基化在血管免疫母細(xì)胞性T細(xì)胞淋巴瘤中的發(fā)生情況。目的是為血管免疫母細(xì)胞性T細(xì)胞淋巴瘤尋找生物學(xué)標(biāo)記物，幫助診斷。
　　方法：
　　(1)研究對(duì)象為2005.01年-2014.11年共60例血管免疫母細(xì)胞性T細(xì)胞淋巴瘤和對(duì)照組淋巴結(jié)反應(yīng)性增生50例，收集石蠟包埋的病理組織，切片并對(duì)組織進(jìn)行DNA提取。
　　(2)選取

3、腫瘤與增生組織共10例，為得到甲基化程度不同，使用Illumina甲基化基因芯片分析。并對(duì)芯片結(jié)果按照基因注釋、CpG注釋分類，進(jìn)行GO和KEGG分析。
　　(3)根據(jù)芯片結(jié)果篩選抑癌基因，對(duì)篩選出來的基因用甲基化特異性PCR(MSP)在大樣本中驗(yàn)證，對(duì)DNA甲基化定性檢測(cè)。在檢測(cè)的基因中找到甲基化發(fā)生率差別最大的基因。
　　(4)對(duì)82例樣本（包括腫瘤53例和增生29例）進(jìn)行甲基化定量檢測(cè)。使用的是焦磷酸測(cè)序技術(shù)。

4、　　(5)亞硫酸氫鹽測(cè)序(BSP)方法被用來對(duì)T淋巴細(xì)胞白血病Jurkat細(xì)胞株進(jìn)行甲基化程度分析。
　　(6)收集隨訪成功病例的相關(guān)臨床參數(shù)及各項(xiàng)指標(biāo)如患者性別、年齡、腫瘤大小、ki67、LDH，甲基化、對(duì)患者生存情況進(jìn)行隨訪。對(duì)以上因素進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，制作生存曲線。
　　結(jié)果：
　　(1)Illumina芯片提示我們基因body以外區(qū)域異常的甲基化發(fā)生于promoter區(qū)和5'UTR區(qū)的頻率較高。異常甲基化多見于C

5、pG shore區(qū)域和島內(nèi)。KEGG和GO分析，得到存在差異基因較多的信號(hào)通路和生物學(xué)功能。得到甲基化差異顯著的基因。
　　(2)對(duì)芯片結(jié)果提示的甲基化差異顯著的抑癌基因sept9、CCDC67、BCL2L10、BBC3、NEIL1、P21和NR4A3使用MSP對(duì)其芯片提示位點(diǎn)的甲基化進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示NR4A3在AITL中甲基化發(fā)生率較高，在增生組中相對(duì)發(fā)生率低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.00)。其他基因并沒有發(fā)現(xiàn)明顯的差異。<

6、br>　　(3)對(duì)NR4A3基因5'UTR區(qū)域上芯片提示位點(diǎn)焦磷酸測(cè)序結(jié)果表明，與對(duì)照組相比NR4A3的5'UTR區(qū)域的四個(gè)CpG位點(diǎn)均在AITL中發(fā)生高甲基化(P＜0.05)。
　　(4) BSP結(jié)果說明在大于或等于50％的甲基化程度出現(xiàn)在T淋巴細(xì)胞白血病jurkat細(xì)胞系中NR4A3在5'UTR區(qū)域的四個(gè)位點(diǎn)上，但在promoter區(qū)域沒有明顯的高甲基化。
　　(5)統(tǒng)計(jì)學(xué)結(jié)果表明，在上述的這些因素中，年齡、性別、腫瘤大

7、小、Ki67、NR4A3甲基化情況跟生存期并沒有相關(guān)性，LDH升高傾向于更少的總體生存時(shí)間(overall survival, OS)(P＜0.05)。
　　結(jié)論：
　　在AITL中，異常甲基化發(fā)生頻率較高。除了基因的body區(qū)域，異常甲基化常發(fā)生于promoter和5'UTR區(qū)域。甲基化差異基因主要富集在合成代謝、發(fā)育、分化、胚胎形成形態(tài)發(fā)生、神經(jīng)突觸、調(diào)節(jié)激酶活性、跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)等生物學(xué)功能。kegg富集得到MARK、腫瘤信號(hào)