高滲鹽水通過EGFR信號通路減輕血腦屏障內皮細胞缺血缺氧損傷的實驗研究.pdf

1、背景:
　　各種原因如顱腦疾病以及全身性疾病導致腦水腫是急危重癥患者的重要致殘和死亡原因。高滲鹽水(HS)與甘露醇均已被《ASA/AHA2007自發(fā)性腦出血治療指南》明確推薦為一線降顱壓藥物。但證據顯示，甘露醇有惡化腎功能、低容量反應和腦水腫“反彈”現(xiàn)象。近年研究發(fā)現(xiàn)，HS在治療腦水腫顱高壓方面比傳統(tǒng)的甘露醇更有優(yōu)勢，效果更好，作用更持久，也無顱內壓“反彈現(xiàn)象”。
　　HS減輕腦水腫的機制未完全明了。產生腦水腫的主要原因是血

2、腦屏障(Blood Brain Barrier,BBB)的破壞，而作為構成BBB基礎的內皮細胞，則是關鍵。內皮細胞以及由其形成的緊密連接位于血管腔內側，是HS治療腦水腫最直接、也是最先接觸的部位。因此，保護BBB的內皮細胞是防治腦水腫的重要靶點。我們已發(fā)現(xiàn)，HS可通過減少腦梗死灶周圍小膠質細胞釋放炎癥因子TNF-α、IL-1β等非滲透性機制減輕腦水腫，但HS是否具有保護BBB內皮細胞的效應以及其作用機制如何，目前尚未清楚。
　　目

3、的:
　　研究HS是否可減輕缺血缺氧導致BBB內皮細胞損傷并探討其作用機制。
　　方法:
　　本研究將采用測定腦組織Evans藍、PCR、MTS、Western blot、流式、TUNEL、免疫熒光、免疫組化、透射電鏡以及腺病毒轉染過表達等技術，通過動物體內和細胞培養(yǎng)兩個層面探討HS對BBB內皮細胞的保護效應，并進一步利用基因測序等方法研究HS減輕缺血缺氧導致內皮細胞損傷的信號傳導通路。
　　結果:
　　首

4、先，通過構建大鼠腦缺血再灌注損傷模型，分假手術組，模型組，生理鹽水組和HS組（10％的HS）。結果發(fā)現(xiàn)，與腦缺血組和生理鹽水組比較，10％的HS組的腦組織Evans藍定量顯著減少(P＜0.05)，但仍然較假手術組增加(P＜0.05);而缺血組與生理鹽水組之間無顯著統(tǒng)計學差異。通過透射電鏡發(fā)現(xiàn)，缺血組的BBB的緊密連接、內皮細胞皺縮、細胞空泡形成等結構明顯破壞，但HS處理后，以上破壞顯著減輕。
　　其次，體外構建糖氧剝奪模型(OGD

5、)，以40mmol/L的HS干預bEnd.3內皮細胞，通過細胞活力測定、流式和TUNEL檢測細胞凋亡、透射電鏡等技術發(fā)現(xiàn):與ODG組相比，HS組顯著改善內皮細胞活力(P＜0.05)，減少細胞凋亡(P＜0.05)，IL-1β表達降低(P＜0.05);透射電鏡發(fā)現(xiàn)，HS干預OGD損傷的bEnd.3內皮細胞后，可顯著減少線粒體破壞與溶解、細胞核皺縮等超微結構。綜合上述的體內、體外實驗提示，HS對缺血缺氧損傷的BBB內皮細胞具有明顯的保護效應。

6、
　　為進一步探討HS保護BBB內皮細胞的非滲透性分子機制，我們通過高通量測序的方法發(fā)現(xiàn):與對照組相比，OGD組中bEnd.3內皮細胞的表皮生長因子受體(EGFR)基因的表達量顯著上調(P＜0.05)，并通過q-PCR驗證了這一表達譜結果。按照這一測序結果，將bEnd.3內皮細胞予40mmol/L的HS干預并作OGD處理，通過Western Blot、免疫組化以及免疫熒光等方法分析顯示，與OGD組相比，內皮細胞的EGFR顯著下降(

7、P＜0.05)，同時細胞凋亡率和IL-1β表達明顯降低(P＜0.05);另外，通過慢病毒載體轉染過表達EGFR，予OGD處理后可顯著增加bEnd.3內皮細胞表達IL-1β(P＜0.05)，并增加凋亡率(P＜0.05)，但令人意外的是，HS并未顯著減少EGFR過表達后bEnd.3內皮細胞的p-EGFR、IL-1β表達和凋亡率，原因可能為過表達EGFR后的BBB內皮細胞的自我調節(jié)功能受損，導致HS對內皮細胞的保護效應喪失。
　　結論: