二烯丙基三硫醚的體內(nèi)外生物轉(zhuǎn)化、抗腫瘤活性及逆轉(zhuǎn)順鉑誘發(fā)腎毒性的初步研究.pdf

1、研究背景：
　　大蒜是百合科蔥屬類植物，在我國有悠久的藥用和食用歷史。流行病學研究顯示，大蒜的日常食用能減少許多癌癥的發(fā)生率。近半個多世紀以來，大蒜中各類成分在抗腫瘤方面的研究在一直處于熱點狀態(tài)，目前已有部分文獻記載了眾多含硫化合物在抗癌方面的突出活性，尤其以前列腺癌的研究最為集中，其次是乳腺癌、結(jié)腸癌、肺癌、胃癌等。據(jù)不完全統(tǒng)計，大蒜中的主要成分二烯丙基硫醚(DAS)，二烯丙基二硫醚(DADS)，二烯丙基三硫醚(DATS)，S-

2、烯丙基巰基半胱氨酸(SAMC)等化合物均報道過抗腫瘤方面的研究。
　　而縱觀當前已上市的大蒜類產(chǎn)品，如大蒜精油、老蒜提取物、蒜粉膠囊和片劑，這些產(chǎn)品多作為保健品應用，其中，大蒜精油，老蒜提取物因其混合物成分復雜，且含有的有效成分含量較低，嚴重限制了其療效的發(fā)揮。而市場上少量的大蒜類藥品也多作為抗細菌和抗真菌類藥物應用，其市場銷售量小，未見其在如抗腫瘤等更為廣泛的臨床應用，究其原因是缺乏更為深入且規(guī)范的研究。
　　綜合分析現(xiàn)有

3、文獻的研究，可總結(jié)出以下缺點:首先是對于目標化合物的選擇過于隨機。如現(xiàn)有文獻中就有報道DAS、DADS、DATS、AMDS、SAC、SAMC，甚至有黑蒜提取物、蒜粉等混合物成分的抗癌作用，少有在結(jié)構(gòu)上探討過構(gòu)效和量效關系的描述，亦少有兼顧其溶解度、穩(wěn)定性以及代謝轉(zhuǎn)化等方面的綜合考量;其次，部分研究僅僅在細胞模型評價了各類化合物的抗腫瘤效果，進而探討各類信號通路機制。由于細胞模型過于理想化，且忽略了藥物進入體內(nèi)的吸收、分布、代謝、排泄過程

4、，特別是無法評價其體內(nèi)免疫調(diào)節(jié)的作用;再者，偶有文獻雖兼顧了體內(nèi)動物模型的驗證，但腫瘤模型的建立過于隨意，如移植腫瘤未生長到指定大小或者剛接種即開始治療流程，甚至在給藥過程中，違背體內(nèi)研究的本意，直接將藥物注射在皮下瘤中;最后，絕大部分研究多為單一成分的體內(nèi)外抗腫瘤研究，少有聯(lián)合用藥的方案研究，且均未考慮有機硫化合物進入體內(nèi)后的吸收、代謝、分布情況?？傊捌谘芯康牟幌到y(tǒng)和欠規(guī)范，使得多數(shù)研究結(jié)果的應用價值較低。
　　本課題大蒜有機

5、硫目標化合物以及疾病治療模型的選擇是綜合考量了化合物的活性、穩(wěn)定性、毒性以及其流行性病學的統(tǒng)計結(jié)果。前期抗腫瘤藥物構(gòu)效關系研究表明，大蒜有機硫化合物中烯丙基和硫元素是藥效官能團，其抗癌活性隨著硫元素數(shù)目的增多而增強，但其穩(wěn)定性降低、毒性也隨之增大，經(jīng)綜合考量后本課題選擇了二烯丙基三硫醚(DATS)單一成分作為化合物研究對象?？鼓[瘤應用模型的選擇是依據(jù)流行性病學統(tǒng)計結(jié)果，大數(shù)據(jù)統(tǒng)計數(shù)據(jù)表明日常大蒜食用在降低胃癌和肺癌發(fā)病率上均有著積極的作

6、用。
　　本課題的實驗設計旨在綜合體內(nèi)和體外兩個方面，對大蒜中含量較高其活性較強的DATS進行了較為深入的藥物代謝和抗腫瘤活性評價，其主要研究內(nèi)容由以下三部分組成:
　　(1)體內(nèi)外藥物代謝研究；
　　(2)抗胃癌和肺癌的藥效學臨床前評價；
　　(3)與順鉑聯(lián)合應用以降低順鉑毒副作用的初步研究。
　　本課題彌補了前期研究的缺陷，為后期蒜類有機硫化合物藥物的開發(fā)利用提供一些有用的實驗依據(jù)。
　　研究設計

7、及結(jié)果：
　　(1)大蒜有機硫化合物DATS的體內(nèi)外代謝及轉(zhuǎn)化途徑研究:
　　在藥物代謝研究方面，通過單劑量和多劑量給藥大鼠DATS，GC-MS分析顯示只在血漿中檢測到了甲基烯丙基亞砜(AMSO)和甲基烯丙基砜(AMSO2)兩個代謝產(chǎn)物，并未檢測到DATS的底物峰，說明DATS在血液中代謝較快。DATS體外代謝研究采用了大鼠紅細胞模型，以HPLC技術(shù)對DATS在大鼠體外的代謝產(chǎn)物進行了定性研究，確證了烯丙基硫醇(AM)和DA

8、DS兩個主要代謝產(chǎn)物;為了解釋體內(nèi)外代謝結(jié)果的不一致性，我們對DATS代謝轉(zhuǎn)化途經(jīng)進行了更為深入的研究。綜合文獻查閱，推測化合物甲基烯丙基硫醚(AMS)可能為其中間產(chǎn)物。根據(jù)甲基化反應原理，驗證AM先在血細胞中甲基化生成AMS，后經(jīng)由肝微粒體氧化反應生成AMSO和AMSO2。而DADS已被報道可轉(zhuǎn)化生成AM。至此，我們得到DATS→DADS→AM→AMS→AMSO→AMSO2的轉(zhuǎn)化路徑。在動力學方面，DATS在體內(nèi)有一個迅速的代謝過程，

9、致使體內(nèi)研究上我們檢測不到原型藥物;但是其代謝產(chǎn)物AMSO，AMSO2，在大鼠血漿中有較長的滯留時間。
　　(2)DATS抗胃癌和肺癌的活性研究:
　　利用體外細胞技術(shù)評價了DATS的抗腫瘤活性，選擇SGC-7901和BGC-823作為胃癌模型，NCI-H460為肺癌模型，結(jié)果顯示DATS對這幾種腫瘤細胞均有明顯的抑制作用，其作用機制通過調(diào)節(jié)cyclin家族蛋白阻滯細胞周期、激活caspase級聯(lián)反應、調(diào)節(jié)bcl-2家族蛋白

10、和MAPK通路誘導細胞凋亡實現(xiàn)的;在體內(nèi)抗腫瘤評價中，通過構(gòu)建人源的腫瘤移植瘤模型，嚴格按照標準操作，即待腫瘤生長到100-200 mm3，進行分組實驗，通過評價包括腫瘤體積、相對腫瘤體積以及相對腫瘤生長率在內(nèi)的主要指標。結(jié)果顯示，與對照組相比，DATS對肺癌和胃癌移植瘤均有明顯的抑制作用，并且裸鼠體重無明顯的降低現(xiàn)象。然而，經(jīng)計算DATS在各腫瘤上的相對腫瘤增長率T/C(％)值，其均未達到低于40％的規(guī)范要求，說明DATS雖然具有一定

11、的抗胃癌和肺癌效果，有可能需要與其它抗腫瘤藥物聯(lián)合使用。通過觀察陽性對照順鉑(DDP)組后，發(fā)現(xiàn)DDP給藥5mg/kg，雖然能達到腫瘤的抑制標準，但是其體重有顯著性降低，從側(cè)面說明DDP對機體的損傷嚴重。鑒于蒜類化合物獨有的機體防護作用的特點，本課題設計了DDP和DATS聯(lián)合治療方案，結(jié)果顯示，DATS不僅具有增強DDP療效的作用，而且DATS聯(lián)用明顯抑制了DDP單用時引起的體重降低的現(xiàn)象。
　　(3)DATS及其活性代謝產(chǎn)物逆轉(zhuǎn)

12、順鉑誘發(fā)的腎毒性研究:
　　順鉑在臨床上存在多種副作用，其中腎毒性是臨床中十分常見的不良反應。因此，本部分著重研究DATS聯(lián)合DDP在改善腎毒方面的積極作用。通過構(gòu)建DDP誘發(fā)的BAL b/c小鼠腎損傷模型，研究DATS對其防治作用，結(jié)果顯示，DATS預處理給藥后，有效降低DDP引起的腎功能異常，如調(diào)節(jié)炎癥因子的表達，修復腎組織中腎小管周圍的損傷和炎癥。
　　在機制研究方面，選擇人腎小管上皮細胞HK-2作為體外模型，經(jīng)細胞活

13、力檢測顯示DATS在體外研究中不具備保護腎細胞的作用?？紤]DATS進入體內(nèi)后形成的其他代謝產(chǎn)物。經(jīng)過GC-MS檢測全血樣本和腎組織勻漿樣本，確認血液、腎組織中均存在一定量的AMSO2。由此本課題以AMSO2作為研究目標，細胞活性實驗表明其對HK-2細胞基本沒有殺傷作用，且聯(lián)用DDP后，能明顯增加細胞活率。此外，AMSO2可有效的調(diào)節(jié)caspase蛋白減少細胞凋亡的發(fā)生，顯著抑制炎癥介質(zhì)COX-2的產(chǎn)生，以及調(diào)節(jié)MAPK（包括ERK，JN

14、K， p38）和NFκB通路減少細胞內(nèi)ROS的異常積累，這些均是AMSO2緩解DDP對HK-2細胞毒性損傷的重要機制。此外，在驗證MAPK特異性抑制劑的作用時，以JNK和ERK的抑制劑有明顯的增加細胞活率和降低細胞凋亡發(fā)生的作用。由此說明，JNK和ERK可能是AMSO2發(fā)揮作用的關鍵因子。
　　結(jié)論：
　　本課題綜合利用體內(nèi)外多種代謝模型研究了DATS的生物轉(zhuǎn)化路徑，并鑒定了主要代謝產(chǎn)物;DATS的體外和裸鼠體內(nèi)抗腫瘤活性規(guī)