D-Ala2-GIP-glu-PAL對MPTP誘導的急性和慢性帕金森病小鼠模型的神經(jīng)保護作用.pdf

1、目的：
　　1.研究D-Ala2-GIP-glu-PAL對MPTP誘導的急性和慢性帕金森?。≒arkinson’s disease，PD）小鼠模型的PD樣癥狀、黑質(zhì)和紋狀體多巴胺能神經(jīng)元和神經(jīng)纖維的丟失、α-突觸核蛋白的表達增多等病理損害是否具有逆轉(zhuǎn)作用。探討D-Ala2-GIP-glu-PAL是否對PD小鼠模型具有神經(jīng)保護作用。
　　2.研究D-Ala2-GIP-glu-PAL是否能夠抑制急性PD小鼠黑質(zhì)的神經(jīng)膠質(zhì)細胞的激

2、活，調(diào)節(jié)凋亡基因Bax和Bcl-2的表達，以及 p-CREBS133的表達，來探討D-Ala2-GIP-glu-PAL治療急性PD小鼠模型的作用機制。
　　3.研究D-Ala2-GIP-glu-PAL是否能夠抑制慢性PD小鼠黑質(zhì)和紋狀體的神經(jīng)膠質(zhì)細胞的激活，抑制脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，調(diào)節(jié)腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（Bain-derived neurotrophic factor，BDNF）的表達，來探討D-Ala2-GIP-glu-PAL治療慢

3、性PD小鼠模型的作用機制。
　　方法：
　　1.急性PD模型
　　1.1.動物分組和給藥：體重25 g左右的雄性C57BL/6小鼠32只，隨機分為四組：對照組、D-Ala2-GIP-glu-PAL組、MPTP組（模型組）和MPTP+D-Ala2-GIP-glu-PAL組（給藥組），每組8只。模型組和給藥組小鼠經(jīng)腹腔注射MPTP（20 mg/kg體重），連續(xù)4次，每次間隔2小時，對照組和D-Ala2-GIP-glu-PA

4、L組注射等量的生理鹽水。在MPTP注射后的第2天，MPTP+D-Ala2-GIP-glu-PAL組小鼠經(jīng)腹腔注射D-Ala2-GIP-glu-PAL（25nmol/kg體重），對照組和MPTP組給與等量的生理鹽水，D-Ala2-GIP-glu-PAL組注射等量的D-Ala2-GIP-glu-PAL，連續(xù)7天。
　　1.2.行為學實驗：在MPTP注射后的第5天進行爬桿實驗，第6天進行曠場實驗。
　　1.3.取材：所有小鼠于MP

5、TP注射后的第7天處死，每組4只取全腦固定后石蠟包埋切片用于免疫組織化學染色。每組其余4只取新鮮全腦分離出腹側(cè)中腦（含黑質(zhì)（SNpc）），用于Western Blot實驗。
　　1.4.采用免疫組織化學染色法檢測小鼠黑質(zhì)和紋狀體酪氨酸羥化酶（tyrosine hydroxylase,TH）的表達，黑質(zhì)膠質(zhì)纖維酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）和離子鈣接頭蛋白（Ionized cal

6、cium-binding adaptor molecule1，IBA1）的表達。
　　1.5.采用Western Blot實驗檢測小鼠黑質(zhì)突觸素（synaptophysin,SYN）、Bax、Bcl-2、p-CREBS133的表達。
　　2.慢性PD模型
　　2.1.動物分組和給藥：體重25 g左右的雄性C57BL/6小鼠48只，隨機分為四組：對照組、D-Ala2-GIP-glu-PAL組、MPTP+丙磺舒組（模型組）

7、和 MPTP+丙磺舒+D-Ala2-GIP-glu-PAL（給藥組）組，每組12只。模型組和給藥組小鼠經(jīng)腹腔注射MPTP（20 mg/kg體重）和丙磺舒（250 mg/kg體重），每3.5天重復注射一次，共注射10次，對照組和D-Ala2-GIP-glu-PAL組注射等量的生理鹽水。從MPTP和丙磺舒注射后的第二天，給藥組和D-Ala2-GIP-glu-PAL組小鼠經(jīng)腹腔注射D-Ala2-GIP-glu-PAL（25nmol/kg體重）

8、，模型組和對照組給與等量的生理鹽水，每天1次，連續(xù)6周。
　　2.2.行為學實驗：在MPTP和丙磺舒注射后的第6周進行曠場實驗、爬桿實驗和轉(zhuǎn)棒實驗。
　　2.3.取材：所有實驗動物于第6周末處死，每組6只取新鮮全腦分離出腹側(cè)中腦（含黑質(zhì)）用于Western Blot實驗。每組其余6只取全腦固定后石蠟包埋切片用于免疫組織化學染色。
　　2.4.采用免疫組織化學染色法檢測小鼠黑質(zhì)和紋狀體TH、α-突觸核蛋白、GFAP、IB

9、A1、4-羥基壬烯醛（4-Hydroxynonenal，4-HNE)的表達，以及黑質(zhì)BDNF的表達。
　　2.5.采用Western Blot實驗檢測小鼠黑質(zhì)α-突觸核蛋白和BDNF的表達。
　　結(jié)果：
　　1.急性PD模型
　　1.1.行為學實驗結(jié)果：
　　曠場實驗的結(jié)果顯示MPTP組小鼠跨越格子的數(shù)目和后腳站立的次數(shù)均明顯少于對照組（P＜0.01），而MPTP+D-Ala2-GIP-glu-PAL組小鼠

10、跨越格子的數(shù)目和后腳站立的次數(shù)卻明顯多于MPTP組（P＜0.05）。爬桿實驗的結(jié)果顯示MPTP組小鼠的T-turn和T-LA均明顯多于對照組（P＜0.001），而MPTP+D-Ala2-GIP-glu-PAL組小鼠的T-turn和T-LA卻明顯少于MPTP組（P＜0.01）。
　　1.2.免疫組化染色結(jié)果：
　　MPTP組SNpc的TH（+）神經(jīng)元的數(shù)目降低到了對照組的27.00％(P＜0.001)，而MPTP+D-Ala2

11、-GIP-glu-PAL組SNpc的TH（+）神經(jīng)元的數(shù)目卻明顯高于MPTP組(P＜0.05)，為對照組的59.4%。MPTP組紋狀體的TH（+）神經(jīng)纖維的染色強度降低到了對照組的56.86%(P＜0.001)，而MPTP+D-Ala2-GIP-glu-PAL組紋狀體的TH（+）神經(jīng)纖維的染色強度卻明顯高于MPTP組(P＜0.01)，為對照組的83.64%。MPTP組黑質(zhì)的GFAP（+）細胞的面積百分比和 IBA1（+）細胞的面積百分比

12、均明顯大于對照組(P＜0.001)，而MPTP+D-Ala2-GIP-glu-PAL組黑質(zhì)的GFAP（+）細胞的面積百分比和IBA1（+）細胞的面積百分比與MPTP組比較均明顯降低(P＜0.001)。
　　1.3.Western Blot結(jié)果：
　　MPTP組黑質(zhì) SYN的表達明顯低于對照組(P＜0.001），而MPTP+D-Ala2-GIP-glu-PAL組小鼠黑質(zhì)SYN的表達卻明顯高于MPTP組（P＜0.01）。與對照組

13、比較，MPTP組黑質(zhì)Bax的表達略微升高，而Bcl-2的表達明顯降低，Bax/Bcl-2比值明顯升高（P＜0.001）。MPTP+D-Ala2-GIP-glu-PAL組小鼠黑質(zhì) Bax的表達雖然與MPTP組無明顯差異，但Bcl-2的表達明顯升高，Bax/Bcl-2比值與MPTP組比較明顯降低（P＜0.01）。MPTP組黑質(zhì)p-CREBS133的表達較對照組明顯降低（P＜0.001），而MPTP+D-Ala2-GIP-glu-PAL組小鼠

14、黑質(zhì)p-CREBS133的表達與MPTP組比較略微升高（P＜0.05）。
　　2.慢性PD模型
　　2.1.行為學實驗結(jié)果：
　　曠場實驗的結(jié)果顯示MPTP+丙磺舒組小鼠跨越格子的數(shù)目和后腳站立的次數(shù)均明顯少于對照組（P＜0.01），而 MPTP+丙磺舒+D-Ala2-GIP-glu-PAL組小鼠跨越格子的數(shù)目和后腳站立的次數(shù)卻均明顯多于MPTP+丙磺舒組（P＜0.05）。爬桿實驗的結(jié)果顯示MPTP+丙磺舒組小鼠的T-

15、turn和T-LA均明顯多于對照組（P＜0.001），而MPTP+丙磺舒+D-Ala2-GIP-glu-PAL組小鼠的T-turn和T-LA卻均明顯少于MPTP+丙磺舒組（P＜0.05）。轉(zhuǎn)棒實驗的結(jié)果顯示MPTP+丙磺舒組小鼠的掉落潛伏期明顯少于對照組（P＜0.001），而MPTP+丙磺舒+D-Ala2-GIP-glu-PAL組小鼠的掉落潛伏期卻明顯長于MPTP+丙磺舒組（P＜0.05）。
　　2.2.免疫組化染色結(jié)果：

16、　　MPTP+丙磺舒組黑質(zhì)的TH（+）神經(jīng)元的數(shù)目降低到了對照組的33.99%(P＜0.001)。而MPTP+丙磺舒+D-Ala2-GIP-glu-PAL組黑質(zhì)的TH（+）神經(jīng)元的數(shù)目卻明顯高于MPTP+丙磺舒組(P＜0.05)，為對照組的59.21%。MPTP+丙磺舒組紋狀體的TH（+）神經(jīng)纖維的染色強度降低到了對照組的56.75%(P＜0.001)。而MPTP+丙磺舒+D-Ala2-GIP-glu-PAL組紋狀體的TH（+）神經(jīng)纖維

17、的染色強度卻明顯高于MPTP+丙磺舒組(P＜0.01)，為對照組的73.33%。MPTP+丙磺舒組小鼠的黑質(zhì)和紋狀體α-突觸核蛋白的染色明顯強于對照組（P＜0.001），并且黑質(zhì)存在大量α-突觸核蛋白強陽性的神經(jīng)元胞體。然而MPTP+丙磺舒+D-Ala2-GIP-glu-PAL組黑質(zhì)和紋狀體α-突觸核蛋白的染色卻明顯弱于MPTP+丙磺舒組（P＜0.05）。MPTP+丙磺舒組黑質(zhì)和紋狀體的GFAP（+）細胞的面積百分比和IBA1(+）細胞

18、的面積百分比均明顯大于對照組(P＜0.001)。而MPTP+丙磺舒+D-Ala2-GIP-glu-PAL組黑質(zhì)和紋狀體的GFAP（+）細胞的面積百分比和IBA1(+）細胞的面積百分比與MPTP+丙磺舒組比較均明顯降低(P＜0.001)。MPTP+丙磺舒組小鼠黑質(zhì)和紋狀體的4-HNE染色強度均明顯高于對照組（P＜0.001），而MPTP+丙磺舒+D-Ala2-GIP-glu-PAL組小鼠黑質(zhì)和紋狀體的4-HNE染色強度卻明顯低于MPTP+

19、丙磺舒組（P＜0.05）。MPTP+丙磺舒組小鼠黑質(zhì)的BDNF（+）細胞的面積明顯低于對照組（P＜0.001），而MPTP+丙磺舒+D-Ala2-GIP-glu-PAL組小鼠黑質(zhì)BDNF（+）細胞的面積卻明顯高于MPTP+丙磺舒組（P＜0.05）。
　　2.3.Western Blot結(jié)果：
　　MPTP+丙磺舒組黑質(zhì)α-突觸核蛋白的表達明顯高于對照組（P＜0.001），而MPTP+丙磺舒+D-Ala2-GIP-glu-PA

20、L組小鼠黑質(zhì)α-突觸核蛋白的表達卻明顯低于MPTP+丙磺舒組（P＜0.05）。MPTP+丙磺舒組小鼠黑質(zhì)的BDNF表達明顯低于對照組（P＜0.001），而MPTP+丙磺舒+D-Ala2-GIP-glu-PAL組小鼠黑質(zhì)BDNF的表達卻明顯高于MPTP+丙磺舒組（P＜0.05）。
　　結(jié)論：
　　1.D-Ala2-GIP-glu-PAL不僅改善了MPTP誘導的急性和慢性PD小鼠模型的運動癥狀，而且抑制了黑質(zhì)和紋狀體多巴胺能神經(jīng)