IDH1R132H促進(jìn)良性前列腺上皮細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化及其作用機(jī)制的研究.pdf

1、前列腺癌(Prostate cancer，PCa)是歐美男性生殖系統(tǒng)常見的惡性腫瘤，其死亡率位居男性惡性腫瘤的第二位。近年來，隨著血清前列腺特異性抗原(Prostate specific antigen，PSA)篩查的逐步推廣，前列腺癌發(fā)病率快速上升，正日益成為嚴(yán)重威脅我國老年男性健康的疾病。目前臨床治療的重大挑戰(zhàn)之一是如何在前列腺癌中區(qū)分哪些腫瘤生長緩慢，哪些腫瘤可能迅速進(jìn)展，威脅生命。即如何判定腫瘤的“惰性(indolent)”與“

2、侵襲性(aggressive)”，并在此基礎(chǔ)上進(jìn)行個體化治療。目前，前列腺癌的過度診斷和過度治療非常嚴(yán)重?，F(xiàn)在普遍應(yīng)用的臨床病理學(xué)參數(shù):Gleason評分，PSA水平，以及臨床病理分期等尚不能很好的判斷預(yù)后。因此，基于分子分型基礎(chǔ)上，對前列腺癌病人進(jìn)行危險分級，來區(qū)分惰性以及侵襲性腫瘤，從而進(jìn)行精準(zhǔn)治療，對前列腺癌的診治至關(guān)重要。
　　異檸檬酸脫氫酶(Isocitrate dehydrogenase，IDH)是體內(nèi)物質(zhì)代謝的關(guān)鍵酶

3、，可以催化異檸檬酸轉(zhuǎn)化成α酮戊二酸（α-ketoglutarate，α-KG），同時增加NADPH的產(chǎn)生。很多腫瘤中都存在異檸檬酸脫氫酶，特別是IDH1/IDH2的突變，這種可能的原癌性質(zhì)的突變可以改變細(xì)胞內(nèi)代謝，產(chǎn)生異常代謝產(chǎn)物以及廣泛的表觀遺傳學(xué)改變。有研究表明，IDH1突變陽性前列腺癌患者代表一種獨(dú)特的分子亞型（以IDH1R132H最常見），但其在前列腺癌發(fā)生發(fā)展中的作用尚不清楚。通過本研究發(fā)現(xiàn)，IDH1R132H在前列腺癌中的發(fā)

4、生率在0.6％(2/336)。體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)具有IDH1R132H的良性前列腺上皮細(xì)胞遷移能力更強(qiáng)，在低細(xì)胞因子情況下，有明顯的增殖優(yōu)勢（前列腺癌細(xì)胞中的作用相反）。進(jìn)一步的研究表明IDH1R132H可以通過表觀遺傳學(xué)修飾的改變抑制miR-141-3p，miR-7-5p，miR-223-3p的表達(dá)，從而使胰島素樣生因子受體1(Insulin-like Growth Factor1Receptor，IGF1R)表達(dá)水平升高，進(jìn)而激活A(yù)KT/

5、STAT3信號通路促使良性前列腺上皮細(xì)胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化。本研究首次較為系統(tǒng)的闡述了IDH1R132H在良性前列腺上皮細(xì)胞中所發(fā)揮的作用以及作用機(jī)制，為IDH1R132H在前列腺癌中的診治提供了一定的依據(jù)。
　　研究目的:
　　1、檢測IDH1R132H在前列腺癌患者中的發(fā)生頻度
　　2、研究IDH1R132H在良性前列腺上皮細(xì)胞及前列腺癌細(xì)胞中所發(fā)揮的功能
　　3、探討IDH1R132H促進(jìn)良性前列腺上皮細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)

6、化的作用機(jī)制
　　研究方法:
　　1、檢測IDH1R132H在前列腺癌患者中的發(fā)生頻度及突變陽性前列腺癌患者的臨床分子病理特征
　　1.1.免疫組織化學(xué)法初步篩查IDH1R132H在前列腺癌組織中的陽性病例。
　　1.2.將初步篩查得到的IDH1R132H陽性病例，通過石蠟組織提取DNA，PCR后進(jìn)行測序分析，進(jìn)一步確定IDH1R132H突變。分析IDH1R132H突變陽性前列腺癌患者的臨床分子病理特征。

7、　　1.3.一代測序檢測前列腺癌及正常細(xì)胞系中IDH1突變情況。
　　2、研究IDH1R132H在良性前列腺上皮細(xì)胞、前列腺癌細(xì)胞中的生物學(xué)功能
　　2.1.慢病毒轉(zhuǎn)染RWPE-1、LNCAP細(xì)胞，形成IDH1R132H，IDH1WT，VECTOR穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞株，嘌呤霉素進(jìn)行抗性篩選，Western Blot、RT-qPCR檢測其表達(dá)效率。
　　2.2.MTS檢測穩(wěn)定表達(dá)IDH1 R132H，IDH1WT，VECTO

8、R后，細(xì)胞增殖能力的變化。
　　2.3.Transwell及劃痕實(shí)驗(yàn)檢測穩(wěn)定表達(dá)IDH1R132H，IDH1WT，VECTOR后，細(xì)胞遷移能力的變化。
　　2.4.RT-qPCR檢測前列腺癌干細(xì)胞以及分化相關(guān)指標(biāo)CD133，CD44，α2β1，AR，PSA等的表達(dá)變化。
　　2.5.AGI5198處理細(xì)胞后，MTS以及Transwell實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞的增殖及遷移能力的變化。
　　3、探討IDH1R132H促進(jìn)良性前

9、列腺上皮惡性轉(zhuǎn)化的作用機(jī)制
　　3.1.檢測IDH1R132H所調(diào)控的microRNA。
　　1)MicroRNA芯片初步篩選IDH1R132H所調(diào)控的microRNA。
　　2)RT-qPCR驗(yàn)證microRNA的變化。
　　3)染色質(zhì)免疫共沉淀(CHIP)實(shí)驗(yàn)檢測在microRNAs啟動子區(qū)H3K4me3和H3K27me3富集情況。
　　3.2.IDH1R132H通過下調(diào)miR-141-3p，miR-7

10、-5p，miR-223-3p促進(jìn)IGF1R的表達(dá)。
　　1)Targetscan軟件預(yù)測miR-141-3p，miR-7-5p，miR-223-3p的共同靶基因。
　　2)Western Blot及免疫熒光實(shí)驗(yàn)檢測穩(wěn)定表達(dá)IDH1R132H，IDH1WT，VECTOR后，IGF1R的蛋白表達(dá)水平。
　　3)在穩(wěn)定表達(dá)IDH1R132H的RWPE-1細(xì)胞中加入microRNA的mimic和陰性對照，Western Blo

11、t檢測其靶基因IGF1R的變化。
　　4)構(gòu)建IGF1R-3'UTR熒光素酶報(bào)告基因表達(dá)載體，將microRNA的mimic以及報(bào)告基因表達(dá)載體共同轉(zhuǎn)染入HEK293T細(xì)胞中，檢測熒光素酶活性。
　　5) MRNA表達(dá)譜芯片檢測IDH1R132H及VECTOR的差異性基因，通過生物信息學(xué)分析IGF1R相關(guān)基因的變化。
　　3.3.驗(yàn)證IDH1R132H通過IGF1R促進(jìn)良性前列腺上皮細(xì)胞RWPE-1惡性轉(zhuǎn)化。
　

12、　1)Western Blot檢測IGF1R下游信號通路AKT，STAT3及磷酸化活性形式的變化。
　　2)siRNA干擾IGF1R后檢測AKT，STAT3以及其磷酸化活性形式的變化。
　　3)siRNA干擾IGF1R，MTS及Transwell實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞增殖遷移能力的變化。
　　研究結(jié)果:
　　1、IDH1R132H在前列腺癌中的發(fā)生率為0.6％(2/336)，IDH1R132H前列腺癌患者缺乏常見的基因突變

13、表型
　　1.1免疫組織化學(xué)(IHC)檢測前列腺癌病例標(biāo)本共計(jì)336例，結(jié)果顯示IDH1R132H表達(dá)強(qiáng)陽性(2+，3+)的病例有4個，IDH1R132H表達(dá)弱陽性(1+)的病例有11個。IDH1R132H主要表達(dá)于前列腺癌組織的細(xì)胞漿和細(xì)胞核中。
　　1.2.通過PCR基礎(chǔ)上的測序證實(shí)IDH1R132H的發(fā)生率為0.6％(2/336)。免疫組化結(jié)果顯示其他重要的前列腺癌相關(guān)的分子特征性改變?nèi)鏓RG重排，SPINK1過表達(dá)等

14、均為陰性。
　　1.3.通過PCR基礎(chǔ)上的測序結(jié)果顯示，前列腺癌細(xì)胞系LNCAP，VCAP，22RV1以及良性前列腺上皮細(xì)胞RWPE-1中均未發(fā)現(xiàn)IDH1R132H突變。
　　2、IDH1R132H促進(jìn)良性前列腺上皮細(xì)胞RWPE-1惡性轉(zhuǎn)化
　　2.1.IDH1R132H促進(jìn)RWPE-1細(xì)胞株細(xì)胞因子的非依賴性生長，促進(jìn)RWPE-1細(xì)胞遷移。
　　2.2.IDH1R132H抑制LNCAP細(xì)胞的增殖和遷移能力。

15、r>　　2.3.IDH1R132H促進(jìn)干細(xì)胞指標(biāo)CD133的表達(dá)。
　　2.4.AGI5198抑制IDH1R132H突變的RWPE-1細(xì)胞增殖及遷移能力。
　　3、IDH1R132H通過改變組蛋白修飾抑制miR-141-3p，miR-223-3p，miR-7-5p的表達(dá)，使IGF1R的表達(dá)水平增高，激活A(yù)KT/STAT3信號通路，從而促進(jìn)RWPE-1細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化
　　3.1.IDH1R132H調(diào)控microRNA的表達(dá)

16、。
　　1)MicroRNA芯片顯示，將IDH1R132H/VECTOR差異兩倍以上的microRNA和IDH1R132H/IDH1 WT差異兩倍以上的microRNA取交集。IDH1R132H中共同上調(diào)的microRNA有4個，共同下調(diào)的microRNA有68個。
　　2)通過查找文獻(xiàn)，在IDH1R132H下調(diào)的microRNA中篩選前列腺癌中具有抑癌功能的microRNA，進(jìn)行PCR驗(yàn)證其表達(dá)，其中miR-141-3p，

17、miR-223-3p，miR-7-5p下調(diào)倍數(shù)最明顯。
　　3)ChIP實(shí)驗(yàn)證明，在miR-141啟動子區(qū)上游P3、P4，miR-7-1的P2、P4，以及miR-223的P2、P3、P4引物擴(kuò)增位置有H3K4me3富集的降低，此外在miR-7-1的P2以及miR-223的P2位置，有H3K27me3的富集升高。
　　3.2 IDH1R132H通過抑制miR-141-3p，miR-7-5p，miR-223-3p的表達(dá)從而使IG

18、F1R的表達(dá)水平升高。
　　1)Targetscan預(yù)測發(fā)現(xiàn)IGF1R為miR-141-3p，miR-7-5p，miR-223-3p的共同靶基因。
　　2)IDH1R132H促進(jìn)RWPE-1細(xì)胞中IGF1R的蛋白表達(dá)。
　　3)穩(wěn)定表達(dá)IDH1R132H的RWPE-1細(xì)胞加入microRNA的mimics后IGF1R的蛋白水平表達(dá)降低。
　　4)雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)證實(shí)IGF1R為miR-141-3p，miR-7-5p

19、，miR-223-3p的靶基因。
　　5)GSEA分析顯示IGF1R所上調(diào)的基因富集在IDH1R132H中。
　　3.3.IDH1R132H通過上調(diào)IGF1R使RWPE-1細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化。
　　1)IDH1R132H促進(jìn)IGF1R下游AKT，STAT3信號通路激活。
　　2)表達(dá)IDH1R132H的RWPE-1細(xì)胞中，干擾IGF1R后P-AKT，P-STAT3的表達(dá)水平降低。
　　3)干擾IGF1R后，表達(dá)I

20、DH1R132H的RWPE-1細(xì)胞增殖能力以及遷移能力均被抑制。
　　研究結(jié)論:
　　1、IDH1R132H在前列腺癌病人中的發(fā)生率為0.6％(2/336)，IDH1突變陽性的前列腺癌病例缺乏其他前列腺癌重要的分子病理特征改變。
　　2、IDH1R132H可以促進(jìn)良性前列腺上皮細(xì)胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化—細(xì)胞因子的非依賴性生長，遷移能力增強(qiáng)。
　　3、IDH1R132H通過抑制miR-141-3p，miR-7-5p，miR