鹿角方中鹿角蛋白的制備及其對兔膝軟骨細胞的保護作用.pdf

1、目的：骨關節(jié)炎是一類老年人高發(fā)的退行性病變，《嚴氏濟生方》中《鹿角丸》是治療骨關節(jié)炎的經典方劑，但是其傳統(tǒng)劑型服用量大，給患者帶來不便。鹿角方組成參考《鹿角丸》的處方組成，對鹿角方中的鹿角蛋白進行提取工藝優(yōu)化及酶解工藝優(yōu)化以提高鹿角蛋白口服生物利用度；通過離體外翻腸囊實驗及細胞藥效的實驗，為鹿角蛋白及鹿角方復方產品口服劑型開發(fā)提供藥動學實驗依據及為其在OA治療方面提供藥效研究基礎。
　　方法：水為提取溶劑采用冷凝回流提取鹿角中總蛋

2、白，以蛋白質含量為考察指標，采取L9（34）正交試驗，對提取時間、提取次數、液料比進行考察，優(yōu)選出鹿角蛋白的提取工藝。使用市面上常見的胃蛋白酶、酸性蛋白酶、胰蛋白酶、堿性蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、風味蛋白酶七種蛋白酶對鹿角蛋白進行水解作用，通過酶解物水解度及體外抗氧化活性的測定，選取合適鹿角蛋白酶解的蛋白酶。優(yōu)選出風味蛋白酶及堿性蛋白酶進行鹿角蛋白雙酶解工藝優(yōu)化，以水解度及蛋白酶解物O2-·抑制率為雙目標，通過Box-Behnke

3、n試驗設計進行鹿角蛋白酶解響應曲面優(yōu)化。建立大鼠外翻腸囊吸收模型，考察鹿角蛋白酶解前后對總氨基酸、羥脯氨酸、甘氨酸的吸收影響。通過兔膝軟骨體外培養(yǎng)，建立IL-1β誘導軟骨細胞炎癥模型及H2O2誘導氧化損傷模型，評價藥物對軟骨細胞的保護作用。
　　結果：⑴通過正交試驗優(yōu)化后，選擇鹿角蛋白終提取工藝為：提取時間為2h，提取次數為4次，料液比1:10。⑵單酶解實驗中，風味蛋白酶酶解物水解度最高，酶解330min后水解度為33.21±9.

4、29％；風味蛋白酶解物·OH清除能力清除能力較強，酶解產物IC50為1.04 mg/mL；堿性蛋白酶酶解物O2-·清除效果最強，酶解產物IC50為1.87mg/mL。⑶通過對鹿角雙酶解實驗結果進行擬合，得到最優(yōu)雙酶解工藝參數為酶解pH7.5，酶解溫度51.6℃，風味蛋白酶：堿性蛋白酶比例為7:3。⑷腸吸收實驗中，酶解后的鹿角蛋白的腸吸收液中，Hyp、Gly及總氨基酸的Q120及Ka較同濃度未酶解的鹿角蛋白皆有顯著提高（P＜0.01）。⑸

5、濃度為10μg/mL的酶解鹿角蛋白及鹿角方藥物都能顯著增加IL-1β誘導的軟骨細胞的增殖（P＜0.05）。酶解鹿角蛋白及鹿角方對H2O2誘導的細胞氧化損都有很好的保護作用，能顯著提高細胞存活率（P＜0.01）。酶解鹿角蛋白及鹿角方藥物在100μg/mL的劑量干預下都能顯著提高（P＜0.05）IL-1β誘導的軟骨細胞內COLⅡ的含量及細胞培養(yǎng)上清中GAG的含量。
　　結論：①通過離體外翻腸囊實驗研究，鹿角蛋白經酶解工藝后，可以大幅提