基于iTRAQ和磁珠分離技術(shù)的類風濕關(guān)節(jié)炎濕熱瘀阻證血清蛋白質(zhì)組學研究.pdf

1、研究背景:
　　類風濕關(guān)節(jié)炎(Rheumatoid Arthritis，RA)是一種以關(guān)節(jié)炎為主要表現(xiàn)的自身免疫性疾病，是導致殘疾的重要原因之一。在祖國醫(yī)學中RA屬于“痹病”、“白虎歷節(jié)”、“旭痹”的范疇，中醫(yī)藥對于RA的治療有著療效好、副作用低、個性化強、花費少的特點。濕熱瘀阻證是RA尤其是活動期RA的重要證型，清熱活血法是治療RA濕熱瘀阻證的主要治療方法。臨床的準確辨證是中醫(yī)臨床療效的保證，目前，在中醫(yī)的臨床診治中，辨證的多樣

2、化、主觀化影響了臨床用藥的準確性。證候的規(guī)范化、客觀化研究一直是中醫(yī)學與現(xiàn)代醫(yī)學結(jié)合研究的重要方面，中醫(yī)學的“證”是人體病理狀態(tài)的反應，“證”的整體性、模糊性、動態(tài)性、差異性、復雜性的特點，使得中醫(yī)的“證”通過現(xiàn)代實驗室檢查所得到的單一微觀理化指標不能整體反應“證”的表達特點，并缺乏足夠的特異性。如何將中醫(yī)理論客觀量化一直是中醫(yī)學與現(xiàn)代醫(yī)學結(jié)合的一個巨大障礙，也是中醫(yī)學進入新的發(fā)展時期以來所面臨的一個瓶頸。以蛋白質(zhì)組學為代表的系統(tǒng)生物學

3、技術(shù)的出現(xiàn)使現(xiàn)代醫(yī)學由還原論思維走向了整體思維，也使得中醫(yī)的理念有了數(shù)理化的可能。蛋白質(zhì)組學的整體性、復雜性、動態(tài)性、信息化的特點和中醫(yī)學的理念不謀而合。蛋白質(zhì)組學技術(shù)在中醫(yī)證候?qū)W的研究中得到了廣泛的應用，并取得了一系列的成果，指導了中醫(yī)的臨床診治。然而在RA的研究中，尚無課題組以蛋白質(zhì)組學的技術(shù)手段對RA濕熱瘀阻證進行深入探討。本課題采用病證結(jié)合的方法，將從探討濕熱瘀阻證的微觀物質(zhì)基礎的角度出發(fā)，分別應用同位素標記相對和絕對定量蛋白質(zhì)

4、組學技術(shù)(iTRAQ)結(jié)合超高效液相色譜-四極桿-靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜(UPLC-QE-MS)以及磁珠分離多肽技術(shù)結(jié)合基質(zhì)輔助激光解吸串聯(lián)飛行時間質(zhì)譜(MALDI-TOF/TOF-MS)，尋找RA濕熱瘀阻證血清差異蛋白，研究差異蛋白應用于RA證候診斷的價值，為進一步的證候?qū)W研究提供參考依據(jù)。
　　研究一:基于iTRAQ技術(shù)的類風濕關(guān)節(jié)炎濕熱瘀阻證差異蛋白質(zhì)組學分析
　　研究目的:篩選RA濕熱瘀阻證差異蛋白，揭示其微觀物質(zhì)基

5、礎，為進一步研究疾病發(fā)病機制及臨床辨治提供依據(jù)。
　　研究方法:本研究共納入病例90例，分為RA濕熱瘀阻證、RA非濕熱瘀阻證、健康志愿者三組，每組各30例，其中男性4例、女性26例;通過SPSS v19.0軟件分析，采用H檢驗的方法統(tǒng)計得出各組間年齡無統(tǒng)計學差異，具有可比性。各組病例樣本血清分別進行混合后，采用同位素標記相對和絕對定量蛋白質(zhì)組學技術(shù)(iTRAQ)進行定量標記，再以超高效液相色譜-四極桿-靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜(UP

6、LC-QE-MS)進行分析檢測。所得質(zhì)譜數(shù)據(jù)選用Thermo ProteomeDiscoverer2.1軟件進行蛋白的檢索和鑒定，當篩選蛋白組間比較差異倍數(shù)≥1.5（上調(diào)）或者≤0.7（下調(diào)），且經(jīng)統(tǒng)計檢驗q-value＜0.05時，定義為組間差異蛋白。生物信息學分析采用DAVID數(shù)據(jù)庫(DAVID Bioinformatics Resources)對所鑒定的差異蛋白進行GO(Gene ontology)注釋、功能注釋聚類分析及KEGG

7、Pathway通路分析，采用STRING數(shù)據(jù)庫對差異蛋白進行相互作用分析。
　　研究結(jié)果:經(jīng)與健康對照組比較分析，共得出RA濕熱瘀阻證差異蛋白72個，其中上調(diào)蛋白25個，下調(diào)蛋白47個，RA非濕熱瘀阻證中得出上調(diào)差異蛋白1個，下調(diào)蛋白11個，濕熱瘀阻證蛋白表達與非濕熱瘀阻證蛋白表達存在明顯差異。通過對濕熱瘀阻證上調(diào)蛋白GO注釋分析，其相關(guān)生物功能主要涉及急性期反應、Fc-gamma片段受體信號通路介導的吞噬作用、受體介導的內(nèi)吞作用

8、、補體激活、血小板脫粒、補體激活經(jīng)典途徑、血小板聚集、蛋白質(zhì)水解、凝血及纖維蛋白凝塊形成9個方面，差異蛋白位置分布涉及10個方面，其中胞外區(qū)、細胞外間隙、胞外外泌體占到了78％，主要參與了抗原結(jié)合、絲氨酸肽鏈內(nèi)切酶激活兩個生物學過程。濕熱瘀阻證下調(diào)蛋白相關(guān)生物學功能主要涉及26個方面包括補體激活的經(jīng)典途徑、補體激活、受體介導的內(nèi)吞作用、免疫反應的調(diào)節(jié)、蛋白質(zhì)水解、免疫反應等方面;差異蛋白所處細胞位置主要分布于胞外區(qū)、胞外外泌體、細胞外間

9、隙、血液微粒、細胞膜等12個方面;所參與生物過程包括抗原結(jié)合、絲氨酸肽鏈內(nèi)切酶激活、膽固醇結(jié)合、脂類結(jié)合等10個方面。在RA濕熱瘀阻證上調(diào)差異蛋白中有6個蛋白表達與急性期炎癥相關(guān)，分別為血清淀粉樣蛋白A1(SAM)、α1-酸性糖蛋白(AGP1)、觸珠蛋白(HP)、α2-酸性糖蛋白(AGP2)、血清淀粉樣蛋白A4(SAA4)及C反應蛋白(CRP);有IGHG3、IGHV1-69、IGHV4-34、IGHL7-434個免疫球蛋白片斷表達與補

10、體激活相關(guān);有3個蛋白表達與血小板聚集、凝血、纖維蛋白凝塊形成相關(guān)，分別為肌動蛋白β(ACTB)、纖維蛋白原α鏈(FGA)、纖維蛋白原γ鏈(FGG);另外FGA、FGG、AGP1、AGP2還與血小板脫粒相關(guān)。這提示RA濕熱瘀阻證與急性炎癥反應及凝血功能的異常密切相關(guān)，在對濕熱瘀阻證上調(diào)蛋白相關(guān)Pathway通路的分析中存在Coagulation and complement cascades、Bacterial invasion of

11、epithelialcells、Shigellosis、Platelet activation通路的激活。在濕熱瘀阻證差異蛋白表達中17個蛋白有文獻支持與RA存在直接相關(guān)性參與了RA的發(fā)病。
　　研究結(jié)論:通過濕熱瘀阻證、非濕熱瘀阻證與健康對照組的對照，從整體上得出了一系列差異蛋白的表達，在濕熱瘀阻證差異蛋白表達中急性期炎性蛋白、凝血相關(guān)蛋白占重要地位，體現(xiàn)出RA濕熱瘀阻證與疾病的活動性存在重要聯(lián)系，與現(xiàn)代醫(yī)家對于濕熱證的研究具有

12、一定的相似性，也為清熱活血法治療RA提供了一定的參考依據(jù)。以iTRAQ技術(shù)篩選差異蛋白的表達，對于研究RA濕熱瘀阻證的客觀物質(zhì)基礎有一定的價值，我們不能簡單的將濕熱證等同于炎性蛋白的表達，但通過這一系列的差異蛋白，使我們在接下來的研究中有了更多的研究方向去探索RA及濕熱瘀阻證的發(fā)病機制，在治療方面，進一步研究中醫(yī)方藥干預對于疾病中蛋白表達的影響，無論對于研究疾病的發(fā)病機制還是對于辨證用藥的精確化都具有重要意義。
　　研究二:基于磁

13、珠分離技術(shù)的類風濕關(guān)節(jié)炎及濕熱瘀阻證血清多肽質(zhì)譜分類模型的建立及驗證
　　研究目的:建立RA血清多肽分類模型及RA濕熱瘀阻證血清多肽分類模型，為臨床診斷提供依據(jù)。
　　研究方法:本研究共納入RA患者40例，其中濕熱瘀阻證20例、非濕熱瘀阻證20例，每組男性2例、女性18例，納入健康對照組20例，其中男性2例、女性18例。通過SPSS v19.0軟件分析，采用H檢驗的方法統(tǒng)計得出各組間年齡無統(tǒng)計學差異，具有可比性。分別以RA患

14、者40例與健康對照組20例進行比較建立RA血清多肽分類模型，以RA濕熱瘀阻證患者20例與非濕熱瘀阻證患者20例比較建立RA濕熱瘀阻證分類模型。研究采用磁珠分離法提取樣本血清多肽，所得樣本多肽經(jīng)點靶干燥后，以基質(zhì)輔助激光解吸串聯(lián)飛行時間質(zhì)譜(MALDI-TOF/TOF-MS)進行檢測，質(zhì)譜數(shù)據(jù)以Clinprotools3.0軟件(CPT3.0)進行分析建立疾病分類模型。再次納入RA患者20例，包括濕熱瘀阻證10例、非濕熱瘀阻證10例，健康

15、對照組10例，其中以RA患者20例與健康對照組10例進行RA血清多肽分類模型;以濕熱瘀阻證10例與非濕熱瘀阻證10例進行RA濕熱瘀阻證血清多肽分類模型驗證。樣本血清處理方法同上，將數(shù)據(jù)調(diào)入CPT軟件計算模型的準確率。
　　研究結(jié)果:RA血清多肽分類模型通過GA-5算法所建立分類模型為最優(yōu)分類模型，由五個多肽組成，其m/z分別為2601.05、4967.6、6639.43、1866.29、8144.63該模型中m/z4967.6、6

16、639.43、8144.63多肽峰經(jīng)統(tǒng)計學分析組間差異P＜0.000001，其中m/z4967.6、6639.43的多肽峰表達強度與RA呈正相關(guān)，m/z8144.63的多肽峰表達強度則與RA呈負相關(guān)。該模型識別率為94.74％，交叉驗證率為81.96％，盲法驗證準確率為97.5％。m/z4967.6、6639.43的多肽峰具有作為RA診斷血清敏感蛋白的潛在可能。RA濕熱瘀阻證血清多肽分類模型由GA-7算法所建立分類模型為最優(yōu)分類模型，由

17、五個多肽組成，其m/z分別為5740.43、4251.35、2863.03、1607.22、4531.5，其中m/z5740.43的多肽峰經(jīng)統(tǒng)計學分析組間差異P＜0.000001，且表達強度與RA濕熱瘀阻證呈正相關(guān)，該模型識別率為97.50％，交叉驗證率為80.05％，盲法驗證準確率為90％，m/z5740.43的多肽峰具有作為RA濕熱瘀阻證血清敏感蛋白的潛在可能。
　　研究結(jié)論:本研究所建立的診斷指紋圖譜模型準確率較高，對RA及