呼腸孤病毒感染體外擴增的CIK及NK細胞后聯(lián)合西妥昔單抗的抗結(jié)直腸癌效應的初步研究.pdf

1、目的：
　　研究體外擴增的自然殺傷細胞（NK）及CIK細胞（CIK）在聯(lián)合西妥昔單抗（cetuximab）后對人EGFR陽性的結(jié)直腸癌細胞株DLD-1及Caco-2的殺傷效應，以及呼腸孤病毒（reovirus）能否進一步增強 CIK及 NK細胞與cetuximab的聯(lián)合抗腫瘤效應，為臨床結(jié)直腸癌的治療提供新的治療策略。
　　方法:
　　從健康獻血者的外周血分離出單個核細胞（PBMC），分別常規(guī)誘導出CIK細胞及NK細胞

2、，收集培養(yǎng)第14天的CIK細胞及NK細胞，ELISA實驗檢測CIK細胞培養(yǎng)上清中IFN-γ及TGF-β的水平，通過流式細胞分析儀分析CIK細胞及NK表型及結(jié)直腸癌細胞DLD-1和Caco-2的EGFR受體的表達水平。分別采用RTCA（RTCA）及乳酸脫氫酶（LDH）釋放實驗檢測NK細胞的細胞毒作用。利用TCID50法和甲基纖維素改良的噬斑實驗測定 reovirus病毒的滴度，使用不同滴度的reovirus病毒感染 CIK細胞及 NK細胞

3、。采用實時無標記分析儀分別動態(tài)監(jiān)測CIK及NK細胞在不同滴度reovirus感染后聯(lián)合cetuximab對DLD-1及Caco-2細胞株的殺傷效應。
　　結(jié)果：
　　流式細胞儀檢測CIK細胞亞群可見培養(yǎng)后CD8+T(67.5±16.5%)、CD3+CD56+NKT(20.1±13.7%)及 CD16+CD56+NK細胞比例（7.0±6.6%）均較培養(yǎng)前 CD8+T(26.7±9.5%)、CD3+CD56+NKT(3.1±1.

4、8%)及CD16+CD56+NK（2.6±2.7%）顯著增高;CIK細胞培養(yǎng)培養(yǎng)上清中細胞因子濃度IFN-γ水平由34.8±35.4 ng/L增高到2041.8±697.9ng/L（P<0.01）,而同時TGF-β的水平由1293.8±633.9ng/L降為116.7±26.8ng/L（P<0.01）；經(jīng)過14天體外擴增培養(yǎng)的NK細胞純度可達86.2%;DLD-1及 Caco-2腫瘤細胞表面均高表達EGFR,分別為81.6%及82.9%

5、；LDH釋放實驗結(jié)果與RTCA檢測所顯示的殺傷趨勢基本一致；TCID50法及噬斑實驗求得病毒滴度分別為2.53×109pfu/L及1.36×109 pfu/L。RTCA檢測發(fā)現(xiàn)NK細胞聯(lián)合西妥昔單抗對結(jié)直腸癌細胞株殺傷作用明顯高于單一的NK細胞組；CIK細胞對DLD-1及Caco-2細胞株的殺傷率分別為16.04±0.87%及27.67±3.10%,而當聯(lián)合使用cetuximab后殺傷率分別增高到31.56±3.55%及35.96±1.