基于環(huán)糊精的兩類基因遞送載體的構(gòu)建及其基因轉(zhuǎn)染特性研究.pdf

1、研究背景：
　　基因治療是很有前景的生物療法之一，在心血管、重癥聯(lián)合免疫缺陷（SCID-X1）、帕金森氏病、Wiskott-Aldrich綜合征、癌癥和神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病等領(lǐng)域中具有極為廣闊的應(yīng)用前景。非病毒載體具有免疫原性小、生產(chǎn)成本低和遞送基因大小不受限制等優(yōu)點(diǎn)，已成為基因治療遞送載體研發(fā)的熱點(diǎn)。但其也存在內(nèi)涵體逃逸及胞內(nèi)攜載基因釋放困難，轉(zhuǎn)染效率低等問題，因此，研究開發(fā)新型高效低毒的基因載體具有十分重要的意義。
　　環(huán)糊

2、精（Cyclodextrin）作為常用的醫(yī)藥用輔料，具有生物相容性好、易于功能化修飾等特性，因而具備成為優(yōu)良基因遞送載體的潛力。由于環(huán)糊精的引入可以降低其他基因載體的細(xì)胞毒性，使得其在基因載體系統(tǒng)的設(shè)計(jì)中受到極大的關(guān)注。環(huán)糊精衍生物可以直接作為基因遞送載體，也可作為連接臂或是修飾物用于其他基因遞送載體的構(gòu)建，還可通過準(zhǔn)聚輪烷或聚輪烷的形式用于基因遞送。雖然環(huán)糊精在基因遞送領(lǐng)域具有極為廣闊的應(yīng)用前景，但仍存在體循環(huán)稀釋穩(wěn)定性差、內(nèi)涵體逃逸

3、能力弱和轉(zhuǎn)染效率低等亟待解決的問題。
　　研究目的：
　　本論文綜合考慮以上研究背景，分別選用β-環(huán)糊精和α-環(huán)糊精為起始原料，設(shè)計(jì)合成兩大類新型基因遞送載體。第一類是以β-環(huán)糊精為起始原料，引入親水的陽(yáng)離子頭部和疏水尾部形成兩親性聚陽(yáng)離子β-環(huán)糊精衍生物。并通過引入不同類型及不同數(shù)目的陽(yáng)離子頭部，以期獲得具有良好生物相容性，可以與質(zhì)粒DNA自聚集并形成穩(wěn)定復(fù)合物和高轉(zhuǎn)染效率的基因載體。第二類是以α-環(huán)糊精為起始原料，制備腙

4、鍵封端的聚輪烷，再引入不同類型和不同數(shù)目的氨基基團(tuán)形成具有酸敏特性的超分子聚輪烷基因載體，以期獲得生物相容性好，具有內(nèi)涵體酸敏刺激—響應(yīng)特性和稀釋穩(wěn)定性的高效基因遞送載體。
　　實(shí)驗(yàn)方法：
　　1、以β-CD為起始原料，與4-甲基苯磺酰氯發(fā)生酯化反應(yīng)，得到6-位單取代的β-CD-OTs。β-CD-OTs與乙二胺進(jìn)一步發(fā)生取代反應(yīng)形成β-CD-EDA。β-CD-EDA與硬脂酸發(fā)生酰胺化反應(yīng)，得到疏水尾部修飾的β-CD-EDA-

5、C18。通過控制反應(yīng)當(dāng)量，以羰基二咪唑橋聯(lián)引入不同數(shù)目的N,N二甲基乙二胺（DMEDA）或PEI600作為親水的氨基陽(yáng)離子頭部，分別得到兩系列（DME系列和PEI系列）6種兩親性聚陽(yáng)離子β-環(huán)糊精衍生物。
　　2、以α-CD為起始原料，與COOH-PEG-COOH在水溶液中形成準(zhǔn)聚輪烷。利用二苯甲酮腙在卡特縮合劑BOP，HOBt，EDIPA作用下對(duì)準(zhǔn)聚輪烷進(jìn)行封端反應(yīng)得到聚輪烷；通過羰基二咪唑橋聯(lián)并控制反應(yīng)當(dāng)量分別引入不同數(shù)目的D

6、MEDA或PEI600作為陽(yáng)離子頭部，得到兩系列（PRDME系列和PRPEI系列）6種α-環(huán)糊精酸敏超分子聚輪烷。
　　3、采用MTT實(shí)驗(yàn)對(duì)兩類12種載體材料的細(xì)胞毒性進(jìn)行評(píng)價(jià)；采用納米粒度分析儀對(duì)載體材料/DNA復(fù)合物的粒徑和zeta電位進(jìn)行表征；通過凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)觀察載體材料對(duì)質(zhì)粒DNA的復(fù)合能力；利用熒光顯微鏡以及流式細(xì)胞儀，以pEGFP基因（CMV啟動(dòng)子調(diào)控的表達(dá)增強(qiáng)綠色熒光蛋白的質(zhì)粒）為報(bào)告基因，以HEK293T細(xì)胞為篩選

7、模型，以基因轉(zhuǎn)染的“黃金標(biāo)準(zhǔn)”PEI25000作為陽(yáng)性對(duì)照，對(duì)合成的12種載體材料轉(zhuǎn)染活性進(jìn)行了評(píng)價(jià)和篩選，并對(duì)優(yōu)選的載體材料在血清存在下的轉(zhuǎn)染活性進(jìn)行了考察。
　　4、利用納米粒度分析儀和透射電子顯微鏡觀察α-環(huán)糊精酸敏超分子聚輪烷PRPEI-2/DNA復(fù)合物的酸敏特性；通過稀釋穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)、溶血實(shí)驗(yàn)對(duì)PRPEI-2/DNA復(fù)合物的稀釋穩(wěn)定性和內(nèi)涵體逃逸能力進(jìn)行評(píng)價(jià)；選用不同細(xì)胞內(nèi)吞途徑抑制劑觀測(cè)了PRPEI-2/DNA復(fù)合物的入

8、胞機(jī)制。
　　結(jié)果與討論：
　　一、兩親性聚陽(yáng)離子β-環(huán)糊精衍生物
　　1、經(jīng)核磁共振氫譜和紅外圖譜鑒定，所合成的兩系列6種兩親性聚陽(yáng)離子β-環(huán)糊精衍生物 DME-1/2/3和 PEI-1/2/3均為目標(biāo)產(chǎn)物?；衔顳ME-1，DME-2和DME-3中，每個(gè)β-環(huán)糊精分子上 DMEDA分子平均接枝度分別為3.0，7.1和10.3個(gè)；化合物PEI-1，PEI-2和PEI-3中，每個(gè)β-環(huán)糊精分子上PEI600分子平均接枝

9、度分別為1.9，3.2和4.6個(gè)。
　　2、MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，連接有DMEDA頭部的DME系列衍生物均顯示較低的細(xì)胞毒性，連接有PEI600頭部的PEI系列衍生物在高濃度時(shí)具有一定的毒性，而且隨著PEI600接枝數(shù)目的增多，材料毒性增大，但其毒性仍低于PEI25000。
　　3、DME系列衍生物中，DME-2和 DME-3與質(zhì)粒DNA形成的復(fù)合物粒徑在1171~2828 nm之間，而DME-1與質(zhì)粒DNA形成的復(fù)合物粒徑在

10、140~369 nm之間。PEI系列衍生物中，復(fù)合物的粒徑均在97~181 nm之間。Zeta電位測(cè)定的結(jié)果顯示，隨著N/P比的增加，兩系列衍生物與DNA復(fù)合物的zeta電位均有所增加。
　　4、凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)顯示，所有材料在重量比5:1時(shí)均可與質(zhì)粒DNA復(fù)合完全，DME-3和PEI-3在N/P=1:1即與DNA復(fù)合完全。
　　5、基因轉(zhuǎn)染活性測(cè)定結(jié)果顯示，DME系列衍生物中，DME-2和DME-3的轉(zhuǎn)染效率較差，與陰性對(duì)照裸

11、DNA相當(dāng)。DME-1在N:P=30:1和50:1時(shí)具有較高的轉(zhuǎn)染活性，雖然陽(yáng)性轉(zhuǎn)染細(xì)胞數(shù)不及陽(yáng)性對(duì)照 PEI25000，但其平均熒光強(qiáng)度優(yōu)于PEI25000。而PEI系列衍生物PEI-1/2/3均具有較高的轉(zhuǎn)染效率，其陽(yáng)性轉(zhuǎn)染細(xì)胞數(shù)和平均熒光強(qiáng)度均優(yōu)于裸DNA。雖然 PEI-2與 PEI-3的陽(yáng)性轉(zhuǎn)染細(xì)胞數(shù)不及PEI25000，但其平均熒光強(qiáng)度在所有N/P比均優(yōu)于PEI25000。PEI-1在N/P=30的情況下其陽(yáng)性轉(zhuǎn)染細(xì)胞數(shù)與陽(yáng)性

12、對(duì)照PEI25000相當(dāng)，PEI-1的平均熒光強(qiáng)度在所有N/P比均優(yōu)于PEI25000。PEI-1陽(yáng)性轉(zhuǎn)染細(xì)胞數(shù)和平均熒光強(qiáng)度均不受血清的影響，而陽(yáng)性對(duì)照PEI25000的陽(yáng)性轉(zhuǎn)染細(xì)胞數(shù)和平均熒光強(qiáng)度在血清存在條件下明顯降低。PEI-1/DNA復(fù)合物入胞機(jī)制研究結(jié)果表明，PEI-1與DNA形成的復(fù)合物主要通過小窩蛋白介導(dǎo)的途徑入胞。
　　二、α-環(huán)糊精酸敏超分子聚輪烷
　　1、經(jīng)核磁共振氫譜和紅外圖譜鑒定，所合成的兩系列6種

13、α-環(huán)糊精酸敏超分子聚輪烷PRDME-1/2/3和 PRPEI-1/2/3均為目標(biāo)物。PRDME系列超分子聚輪烷PRDME-1，PRDME-2和PRDME-3中，每個(gè)α-環(huán)糊精分子上DMEDA分子平均接枝度分別為1.7，6.3和10.0個(gè)；PRPEI系列超分子聚輪烷PRPEI-1，PRPEI-2和PRPEI-3中，每個(gè)α-環(huán)糊精分子上PEI600分子平均接枝度分別為1.1，2.9和4.1個(gè)。
　　2、MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與PEI2

14、5000相比，6種α-環(huán)糊精酸敏超分子聚輪烷均顯示較低的細(xì)胞毒性。隨著聚輪烷接枝的氨基陽(yáng)離子數(shù)目增多，細(xì)胞毒性略有增加，但其毒性遠(yuǎn)低于PEI25000。連接PEI數(shù)目最多的聚輪烷PRPEI-3在高濃度100μg/mL時(shí)其細(xì)胞存活率為PEI25000的1.6倍。
　　3、PRDME系列超分子聚輪烷中，PRDME-1與質(zhì)粒DNA形成的復(fù)合物粒徑在1973~3468 nm之間，PRDME-2與 PRDME-3與質(zhì)粒DNA形成的復(fù)合物粒徑

15、在92~232 nm之間。而PRPEI系列的超分子聚輪烷PRPEI-1/2/3與質(zhì)粒DNA形成的復(fù)合物粒徑在81~123 nm之間。Zeta電位測(cè)定結(jié)果顯示，隨著N/P比的增加兩系列復(fù)合物的zeta電位均有所增加。
　　4、凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，所得聚輪烷均具有極好的DNA負(fù)載能力，除了PRDME-1在重量比為10:1與DNA復(fù)合完全，其余均在重量比1:1時(shí)與質(zhì)粒DNA復(fù)合完全。
　　5、基因轉(zhuǎn)染活性測(cè)定結(jié)果顯示，帶有DME

16、DA氨基基團(tuán)的聚輪烷PRDME-1/2/3轉(zhuǎn)染活性較差，與裸的質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染活性相當(dāng)。而帶有PEI600基團(tuán)的聚輪烷PRPEI-1/2/3均顯示較高的轉(zhuǎn)染活性，其陽(yáng)性轉(zhuǎn)染細(xì)胞數(shù)和平均熒光強(qiáng)度均優(yōu)于裸DNA。在聚輪烷PRPEI-1/2/3中，具有適中氨基密度的PRPEI-2轉(zhuǎn)染活性最高，其陽(yáng)性轉(zhuǎn)染細(xì)胞數(shù)和平均熒光強(qiáng)度在相同N/P比的情況下均優(yōu)于其他兩種聚輪烷。雖然超分子聚輪烷PRPEI-1和PRPEI-3的陽(yáng)性轉(zhuǎn)染細(xì)胞數(shù)不及PEI2500

17、0，但其平均熒光強(qiáng)度在重量比為30和50時(shí)與PEI25000相當(dāng)。超分子聚輪烷PRPEI-2的陽(yáng)性轉(zhuǎn)染細(xì)胞數(shù)與陽(yáng)性對(duì)照 PEI25000相當(dāng)，其平均熒光強(qiáng)度在重量比30和50時(shí)分別是PEI25000的1.4和1.3倍。PRPEI-2的陽(yáng)性轉(zhuǎn)染細(xì)胞數(shù)和平均熒光強(qiáng)度均不受血清存在的影響，而陽(yáng)性對(duì)照PEI25000的陽(yáng)性轉(zhuǎn)染細(xì)胞數(shù)和平均熒光強(qiáng)度在血清存在條件下明顯降低。
　　6、PRPEI-2/DNA復(fù)合物酸敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，pH7.4孵

18、育時(shí)，透射電鏡觀測(cè)到PRPEI-2/DNA復(fù)合物為規(guī)則的球形納米粒，但在pH5.0孵育時(shí)，其粒徑和形態(tài)都發(fā)生了顯著的改變，粒徑從158 nm（pH7.4）變?yōu)?55 nm（pH5.0）且粒徑分布出現(xiàn)了多重峰，復(fù)合物形態(tài)松散且不規(guī)則。上述結(jié)果表明PRPEI-2/DNA復(fù)合物具有酸敏刺激響應(yīng)特性，可以在血液循環(huán)和胞外環(huán)境中保持相對(duì)穩(wěn)定（pH7.4），但在酸性的內(nèi)涵體中（pH5.0）復(fù)合物結(jié)構(gòu)變得松散膨大，使得聚輪烷與 DNA之間的相互作用減

19、弱，從而有利于DNA從復(fù)合物中釋放。
　　7、溶血實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與pH7.4相比，超分子聚輪烷PRPEI-2/DNA復(fù)合物在pH5.0時(shí)具有更強(qiáng)的膜破壞能力。進(jìn)一步的掃描電子顯微鏡觀察結(jié)果表明，當(dāng)PRPEI-2/DNA復(fù)合物與紅細(xì)胞在pH7.4孵育時(shí)，紅細(xì)胞形態(tài)完整，呈現(xiàn)雙面微凹之圓盤狀。當(dāng)其與紅細(xì)胞在 pH5.0孵育時(shí)，紅細(xì)胞的細(xì)胞膜上出現(xiàn)了孔洞，細(xì)胞溶脹甚至破裂。上述結(jié)果表明超分子聚輪烷PRPEI-2是一個(gè)很有前景的基因載體材

20、料，其酸敏-刺激響應(yīng)特性有利于基因載體復(fù)合物的內(nèi)涵體逃逸，大大提高其基因轉(zhuǎn)染效率。
　　8、稀釋穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，PRPEI-2可以與質(zhì)粒DNA形成粒徑為160 nm的納米粒，而且其粒徑及粒徑分布可以在稀釋至128倍時(shí)仍然保持穩(wěn)定。相反地， PEI25000/DNA形成的復(fù)合物在稀釋至16或32倍時(shí)，復(fù)合物納米粒粒徑變得不均一，出現(xiàn)解聚或形成團(tuán)塊，其粒徑與稀釋前相比分別增加了1.5或2倍，且粒徑分布范圍變寬，PDI增加到0.37

21、。這些結(jié)果表明超分子聚輪烷PRPEI-2與質(zhì)粒DNA形成的復(fù)合物可以有效對(duì)抗進(jìn)入體內(nèi)后的血液稀釋，具備優(yōu)良基因治療載體的特性。
　　9、復(fù)合物入胞機(jī)制研究結(jié)果表明，當(dāng)加入網(wǎng)格蛋白內(nèi)吞抑制劑氯丙嗪的濃度為15，20和30μM時(shí)，與不加抑制劑的對(duì)照組相比，轉(zhuǎn)染效率分別降低了45.7％，70.8%和99.4%；當(dāng)加入小窩蛋白抑制劑金雀異黃酮濃度為75μM時(shí)，復(fù)合物轉(zhuǎn)染效率與對(duì)照組相當(dāng)，當(dāng)濃度繼續(xù)增大到150和200μM時(shí)，與不加抑制劑的

22、對(duì)照組相比，轉(zhuǎn)染效率分別降低了46.9%和49.7%；而當(dāng)加入巨胞飲抑制劑阿米洛利濃度高達(dá)200μM時(shí)，PRPEI-2/DNA復(fù)合物的轉(zhuǎn)染效率依然保持不變。上述結(jié)果表明，PRPEI-2/DNA復(fù)合物主要通過網(wǎng)格蛋白和小窩蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞途徑入胞，而網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞機(jī)制對(duì)其轉(zhuǎn)染效率影響更大。網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞通常涉及網(wǎng)格蛋白的內(nèi)化并將內(nèi)吞物轉(zhuǎn)移至內(nèi)涵體和溶酶體降解，因此對(duì)于經(jīng)網(wǎng)格蛋白內(nèi)吞作用進(jìn)入細(xì)胞的基因載體來說，提高其內(nèi)涵體逃逸能力尤為

23、重要。本文在超分子聚輪烷PRPEI-2中引入內(nèi)涵體酸性環(huán)境下刺激響應(yīng)的腙鍵，對(duì)提高PRPEI-2/DNA的基因轉(zhuǎn)染活性具有重要的意義。
　　結(jié)論：
　　1、設(shè)計(jì)并合成了兩類12種基于環(huán)糊精的新型兩親性聚陽(yáng)離子β-環(huán)糊精衍生物和α-環(huán)糊精酸敏超分子聚輪烷基因載體。核磁及紅外鑒定結(jié)果表明所得載體材料與目標(biāo)物結(jié)構(gòu)一致。
　　2、所構(gòu)建的12種載體材料均具有較低的毒性，兩類載體中α-環(huán)糊精酸敏超分子聚輪烷類具有更好的生物相容性

24、。
　　3、連接PEI600的載體材料其轉(zhuǎn)染活性均優(yōu)于連接DMEDA的載體材料，且氨基基團(tuán)的數(shù)目會(huì)影響其轉(zhuǎn)染效率。其中PEI-1和PRPEI-2在同類載體材料中轉(zhuǎn)染活性最高，在含血清條件下依然能夠保持良好的轉(zhuǎn)染活性，且均優(yōu)于PEI25000。
　　4、PEI-1與DNA形成的復(fù)合物主要通過小窩蛋白介導(dǎo)的途徑入胞，該途徑可以避免被溶酶體降解，有利于提高該類基因遞送系統(tǒng)的轉(zhuǎn)染效率；PRPEI-2載體系統(tǒng)具有良好的稀釋穩(wěn)定性和酸敏