眼鏡蛇毒NGF通過PI3K-Akt和TGF-β-Smad信號通路對HSC-T6細(xì)胞的影響.pdf

1、目的:對現(xiàn)有廣西眼鏡蛇毒NGF分離純化方法進(jìn)行優(yōu)化，以獲得高活性高純度的NGF。研究NGF通過PI3K/Akt、TGF-β/Smad信號通路誘導(dǎo)HSC-T6細(xì)胞凋亡的機制，為NGF應(yīng)用于肝纖維化的預(yù)防與治療提供理論依據(jù)
　　方法:
　　(1)采用DEAE Sepharose CL-6B陰離子交換層析柱、shephadexG-50分子組、Macro Prep High S陽離子預(yù)裝柱對眼鏡蛇毒NGF進(jìn)行分離純化;
　　(

2、2) PC12細(xì)胞測定各層析柱洗脫峰的NGF活性，再利用SDS-PAGE電泳測定具有NGF活性洗脫峰的相對分子質(zhì)量;
　　(3) CCK-8法分別檢測NGF（終濃度分別為0.1、0.5、1、2、4μg/ml）和PI3K/Akt信號通路的特異性抑制劑LY294002(50μmol/L)和TGF-β/Smad信號通路特異性抑制劑LY2157299（50μmol/L）對大鼠肝星狀細(xì)胞(HSC-T6)的增殖、增殖抑制率的影響;
　　

3、(4)采用流式細(xì)胞技術(shù)檢測NGF的有效濃度、LY294002和LY2157299對HSC-T6凋亡的影響;
　　(5) Western-Blot檢測在NGF作用不同時間后(0、5、10、30、60、120min和24h)，PI3K/Akt、TGF-β/Smad信號通路中Akt、Smad3的磷酸化水平變化;
　　(6) Western-Blot分別檢測用最小有效濃度NGF、PI3K/Akt信號通路抑制劑LY294002（50μ

4、mol/L）、以及NGF聯(lián)合LY294002分別作用細(xì)胞后信號通路中Akt的磷酸化水平變化;NGF、TGF-β/Smad信號通路抑制劑LY2157299（50μmol/L）、NGF聯(lián)合LY2157299分別作用細(xì)胞后信號通路中Smad3的磷酸化蛋白表達(dá)水平;
　　(7)Western-Blot檢測當(dāng)用LY2157299后對Akt蛋白磷酸化水平的影響，用LY294002后Smad3的磷酸化水平的變化。
　　結(jié)果:
　　(

5、1)眼鏡蛇毒經(jīng)DEAE Sepharose CL-6B離子膠柱分離廣西眼睛蛇毒分離出3個峰，前兩個為穿透峰，最后一個為洗脫峰，最后一個峰具有NGF活性;shephadex G-50分離上一步第3峰，NGF活性在第二峰;MacroPrep High S陽離子膠預(yù)裝柱對具有NGF的第二峰進(jìn)行再分離得到3個峰;
　　(2)PC12細(xì)胞鑒定各個峰發(fā)現(xiàn)Macro Prep HighS分離的第3峰后半部分具有NGF活性;SDS-PAGE檢測N

6、GF為電泳純，非還原性電泳分子量為23KD，還原性電泳為14KD; NGF得率為0.24％;
　　(3)CCK8結(jié)果顯示NGF在濃度為1、2、4μg/ml時能夠抑制HSC-T6細(xì)胞增殖，與空白組相比各組的抑制率均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01);信號通路抑制劑對HSC-T6細(xì)胞具有增殖抑制作用（P＜0.01）;
　　(4)流式細(xì)胞儀檢測得出1、2、4μg/ml的NGF和抑制劑作用細(xì)胞24小時后，各組產(chǎn)生不同的凋亡率，與空白組相

7、比均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01);且隨著NGF濃度的增加凋亡率逐漸升高;NGF的最小有效濃度為1μg/ml;
　　(5)各個時間段內(nèi)的Akt，Smad3的磷酸化水平均低于正常組（P＜0.05），在NGF作用時間超過30min時Akt、Smad3蛋白磷酸化水平隨著NGF作用時間增長而逐漸降低。
　　(6)p-Akt的表達(dá)量空白組＞NGF組＞LY294002組＞NGF+LY294002組，p-Smad3的表達(dá)量空白組＞NGF組＞

8、LY2157299＞NGF+LY2157299組。且各組與空白組相比差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。
　　(7)LY2157299作用細(xì)胞后，PI3K/Akt信號通路中p-Akt/Akt的表達(dá)量依次為空白組＞ NGF組＞LY2157299＞ NGF+ LY2157299組，且與空白組差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。LY294002作用細(xì)胞后，TGF-β/Smad信號通路中p-Smad3/Smad3的表達(dá)量依次為空NGF組、

9、LY294002、NGF+LY294002組均低于空白組，且與空白組比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），但是實驗組之間變化不大差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。
　　結(jié)論:
　　(1)利用DEAE Sepharose CL-6B+Sephadex G-50+Macro-prepHighS分離出電泳純、具有高生物活性的NGF。
　　(2)NGF可能通過調(diào)節(jié)能影響HSC-T6活化的信號通路PI3K/Akt、TGF-β/

10、Smad電的關(guān)鍵蛋白Akt、Smad3磷酸化蛋白表達(dá)量，抑制HSC-T6的增殖。
　　(3)NGF能通過降低PI3 K/Akt、TGF-β/Smad中Akt、Smad3的磷酸化表達(dá)水平來誘導(dǎo)HSC-T6細(xì)胞的凋亡。
　　(4)PI3K/Akt特異性抑制劑LY294002也能抑制Smad3的磷酸化蛋白表達(dá)，TGF-β/Smad抑制劑LY2157299也能抑制Akt磷酸化蛋白表達(dá)。PI3K/Akt、TGF-β/Smad兩條通路之