轉(zhuǎn)位蛋白18KDa配體ZBD-2神經(jīng)保護作用及治療產(chǎn)后抑郁的實驗研究.pdf

1、研究背景:
　　產(chǎn)后抑郁癥（postpartum depression,PPD）是最常見的分娩并發(fā)癥。是女性分娩后，由于社會角色、體內(nèi)激素水平、外界刺激等變化所帶來情緒紊亂。調(diào)查顯示，大約15-20％的產(chǎn)婦將會經(jīng)歷各種不同程度的PPD癥狀。癥狀包括快感缺乏，睡眠障礙，悲傷，絕望，認知障礙等。PPD不僅嚴(yán)重影響孕產(chǎn)婦的身心健康，而且對嬰幼兒情緒、智力發(fā)育、行為發(fā)展等方面具有很大的消極影響。因此，對PPD的干預(yù)和治療顯得尤為重要。但是

2、PPD的發(fā)病機制非常復(fù)雜，至今尚未完全闡明，缺乏針對性治療措施。
　　興奮性突觸傳遞與抑制性突觸傳遞的平衡是大腦中樞神經(jīng)系統(tǒng)（Central nervous system,CNS）發(fā)揮正常功能的基礎(chǔ)。谷氨酸（glutamic acid, Glu）作為CNS中最重要的興奮性神經(jīng)遞質(zhì)，它的過量釋放將導(dǎo)致興奮性神經(jīng)毒性的發(fā)生，繼而誘導(dǎo)神經(jīng)元死亡。N-甲基-D-天冬氨酸（N-Methyl-D-aspartic acid,NMDA）受體是離

3、子型谷氨酸受體，在哺乳動物的CNS中，NMDA受體介導(dǎo)的快速興奮性神經(jīng)傳遞參與了廣泛的生理和病理過程。NMDA受體作為一個潛在的神經(jīng)保護的“傳感器”，參與了神經(jīng)元存活，神經(jīng)元樹突、軸突結(jié)構(gòu)發(fā)育及突觸可塑性的形成。此外，NMDA受體與記憶的形成和保持密切相關(guān)，所以NMDA受體在神經(jīng)元損傷的神經(jīng)系統(tǒng)疾病中備受關(guān)注。已有文獻報導(dǎo)TSPO通過減少小膠質(zhì)細胞活化介導(dǎo)神經(jīng)元保護作用，然而TSPO是否參與調(diào)控谷氨酸興奮性毒性尚不清楚。
　　γ-

4、氨基丁酸（γ-aminobutyric acid,GABA）是腦內(nèi)最重要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，其功能紊亂與產(chǎn)后抑郁發(fā)病關(guān)系密切。研究表明，孕期孕激素的大量增加，分娩后的急劇減少對GABAAR產(chǎn)生相當(dāng)大的影響。分娩前孕激素的高水平狀態(tài)使產(chǎn)婦神經(jīng)元中GABAAR與苯二氮?結(jié)合率降低，神經(jīng)活動的抑制性下降，興奮性增高，孕婦容易出現(xiàn)負面情緒。而產(chǎn)后孕激素大幅下降使去甲腎上腺素能、多巴胺能神經(jīng)系統(tǒng)對機體的興奮性降低，GABA能神經(jīng)系統(tǒng)的抑制性相對增強

5、，最終導(dǎo)致 CNS功能下降，表現(xiàn)出意志力低下，思維能力、記憶力減退，從而增加PPD的易患性。提示：GABAR是抗PPD藥物的重要靶點。
　　杏仁核（amygdala），附著在海馬的末端，呈杏仁狀，是邊緣系統(tǒng)的一部分。是產(chǎn)生情緒，識別情緒，調(diào)節(jié)情緒及控制學(xué)習(xí)和記憶的腦部重要組織。杏仁核根據(jù)結(jié)構(gòu)和功能被分為三部分，側(cè)核（lateral amygdala,LA）、基底外側(cè)核（basolateral amygdala,BLA）和中央核（c

6、entral amygdala,CeA）。其中BLA是杏仁核復(fù)合體最大的核，是神經(jīng)可塑性發(fā)生的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)，也是情感輸入的重要樞紐。通過鈣調(diào)蛋白激酶標(biāo)記檢測，BLA主要由Glu能神經(jīng)元和形態(tài)相似的皮層錐體神經(jīng)元以及少量GABA能中間神經(jīng)元組成。如果 BLA在發(fā)育初期出現(xiàn)缺陷，很可能導(dǎo)致后期出現(xiàn)精神障礙，如恐慌，害怕等。杏仁核與皮質(zhì)之間有著廣泛的往返纖維聯(lián)系，這些聯(lián)系主要參與記憶、情緒活動的調(diào)節(jié)。
　　轉(zhuǎn)位蛋白18KDa（Translo

7、cator protein,TSPO）是五次跨膜結(jié)構(gòu)域蛋白，廣泛分布于中樞和外周組織細胞線粒體外膜上。TSPO參與膽固醇從線粒體膜外到膜內(nèi)的轉(zhuǎn)運，是類固醇及神經(jīng)甾體合成的限速步驟，而神經(jīng)類固醇作為調(diào)控情緒和應(yīng)激反應(yīng)的重要因素，提示TSPO可能參與精神系統(tǒng)疾病的發(fā)生發(fā)展過程。研究發(fā)現(xiàn)，TSPO配體XBD173具有良好的抗焦慮作用而沒有苯二氮?類藥物的副作用。此外，重復(fù)使用XBD173未發(fā)現(xiàn)嚙齒類動物的戒斷癥狀。我們實驗室在XBD173分子

8、結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上，進一步優(yōu)化以增加血腦屏障通過率，合成了化合物（C27H27N5O2）ZBD-2（專利號：201210047188.6），發(fā)現(xiàn)ZBD-2與TSPO親和力高，水溶性良好，對慢性痛引起的焦慮具有良好的治療作用。然而，ZBD-2對興奮性神經(jīng)毒性損傷以及產(chǎn)后抑郁癥的干預(yù)作用尚不清楚。
　　研究目的:
　　首先闡明TSPO配體ZBD-2對腦缺血再灌注和NMDA誘導(dǎo)的神經(jīng)毒性的保護作用及機制。接著深入考察TSPO配體ZBD-2

9、對 PPD模型小鼠行為學(xué)的影響，檢測TSPO在PPD模型小鼠BLA區(qū)的表達差異，利用分子生物學(xué)等手段揭示激活TSPO調(diào)控BLA中GABA能抑制性傳遞發(fā)揮抗PPD的作用機制。為治療PPD藥物的研發(fā)提供新靶點，為PPD的治療提供新策略。
　　研究方法：
　　第一部分：體外培養(yǎng)原代皮層神經(jīng)元，建立NMDA細胞損傷模型；建立體內(nèi)大腦中動脈栓塞（MCAO）模型，評價ZBD-2的神經(jīng)保護作用。原代皮層神經(jīng)元在培養(yǎng)至第10天的時候，分別給

10、予1μM和10μM的ZBD-2，孵育24小時后，用200μM的NMDA處理30min，換用完全培養(yǎng)液（含ZBD-2）繼續(xù)培養(yǎng)24小時后收集細胞。用MTT法檢測細胞的活力表現(xiàn)，用Hoechst/PI雙染法檢測細胞的凋亡狀況。小鼠腹腔給藥第7天時，進行MCAO損傷實驗。用2% TTC染色檢測小鼠大腦冠狀剖面損傷體積的變化；用Nissl染色法檢測前額葉皮質(zhì)與海馬神經(jīng)元細胞損傷情況；用蛋白免疫印跡（Western blot,WB）方法觀察NMD

11、A受體GluN2A、GluN2B，及Bcl-2、Bax、和pro-caspase-3蛋白含量變化。
　　第二部分：采用激素模擬妊娠狀態(tài)（hormone-simulated pregnancy,HSP）后激素突然撤停的方法制備PPD模型，評價ZBD-2對PPD的治療作用。采用曠場（open field test，OF）、高架十字迷宮（elevated plus maze, EPM）、糖水偏好（Sucrose preference t

12、est,SPT）、懸尾（Tail suspensiontest,TST）和強迫游泳（forced swimming test, FST）等實驗方法，檢測ZBD-2激活TSPO后，PPD小鼠行為學(xué)的改變；免疫組化（Immunohistochemistry,IHC）實驗檢測TSPO在基底外側(cè)杏仁核（BLA）的表達；HE染色法檢測激活TSPO對BLA區(qū)神經(jīng)元形態(tài)的影響；ELISA方法檢測TSPO對下丘腦-垂體-腎上腺軸（hypothalamo

13、-pituitary-adrenal,HPA）激素和單胺類遞質(zhì)5-HT含量的影響；WB法觀察激活 TSPO對腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（brain-derived neurotrophic factor,BDNF）和環(huán)磷腺苷效應(yīng)元件結(jié)合蛋白（cAMP-response element binding protein,CREB），以及對興奮性神經(jīng)神經(jīng)遞質(zhì)Glu受體和抑制性神經(jīng)遞質(zhì)GABA受體表達的影響。
　　結(jié)果：
　　第一部分：

14、r>　　1.ZBD-2通過減少 NMDA受體GluN2B表達，降低Bax/Bcl-2比值，上調(diào)pro-Caspase-3水平，從而減少NMDA引起的興奮性毒性損傷，具有促進細胞存活和抑制細胞凋亡的作用。
　　2.ZBD-2可以減少大腦梗死體積，改善神經(jīng)功能缺損評分以及改善小鼠額葉皮層和海馬區(qū)神經(jīng)元的形態(tài)。
　　第二部分：
　　1. TSPO在正常小鼠BLA高表達，ZBD-2對PPD小鼠BLA神經(jīng)元具有保護作用。

15、　　2. ZBD-2可以緩解PPD模型小鼠抑郁樣行為，作用機制與調(diào)控HPA軸激素、增強5-HT分泌、降低興奮性突觸蛋白表達、激活GABAAR、促進BDNF-CREB信號系統(tǒng)表達、調(diào)節(jié)神經(jīng)元可塑性密切相關(guān)。
　　結(jié)論：
　　本研究表明，TSPO配體ZBD-2對NMDA受體介導(dǎo)的興奮性毒性損傷具有神經(jīng)保護作用。TSPO在正常小鼠BLA高表達，在PPD小鼠BLA表達顯著下降。PPD小鼠灌胃給藥ZBD-2一周后，具有明顯的抗PPD作