轉(zhuǎn)位蛋白18kDa(TSPO)的腦保護(hù)作用及可能機(jī)制研究.pdf

1、本文主要從以下幾個部分展開論述：
　　第一部分 海馬CA1區(qū)TSPO過表達(dá)對小鼠認(rèn)知損害的保護(hù)作用及機(jī)制
　　目的:對神經(jīng)損傷保護(hù)作用的研究是當(dāng)今的科研熱點(diǎn)之一。轉(zhuǎn)位蛋白18kDa(TSPO)在中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)主要由膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)，其位于線粒體外膜，參與將膽固醇由線粒體膜外轉(zhuǎn)運(yùn)至膜內(nèi)。TSPO在神經(jīng)損傷狀態(tài)下表達(dá)會顯著增加，但TSPO的此種調(diào)節(jié)在神經(jīng)損傷過程中所起的作用尚不明確。本實驗使用脂多糖(LPS)外周給藥導(dǎo)致小鼠認(rèn)知功能

2、障礙的模型，通過慢病毒轉(zhuǎn)染使小鼠海馬CA1區(qū)TSPO過表達(dá)，以驗證其是否可改善認(rèn)知功能障礙，并且探討這種保護(hù)作用與神經(jīng)甾體的關(guān)系。
　　方法:根據(jù)微注射慢病毒類型、是否腹腔注射LPS及是否腹腔注射非那雄胺(FN)，將C57BL/6J小鼠按體重隨機(jī)分成8組(12只/組):NC組、TSPOoe組、NC+LPS組、TSPOoe+LPS組、NC+LPS+FN組、TSPOoe+LPS+FN組、NC+FN組及TSPOoe+FN組。第0天使用腦

3、立體定向裝置將陰性對照病毒(NC)或TSPO過表達(dá)慢病毒(TSPOoe)注入實驗小鼠雙側(cè)海馬CA1區(qū)。從第15天開始直至行為實驗結(jié)束（第26天）向相應(yīng)組別的小鼠腹腔內(nèi)注射非那雄胺(5mg/kg)或?qū)φ杖軇?0min后再注射LPS(250μg/kg)或?qū)φ杖軇?，每天一次。?2天起在LPS注射后30min進(jìn)行Morris水迷宮實驗。最后收集實驗小鼠海馬穿刺區(qū)的組織，使用Western-blotting法測定TSPO表達(dá)量，使用ELISA

4、試劑盒測定神經(jīng)甾體含量。
　　結(jié)果:(1)在Morris水迷宮隱藏平臺獲得實驗里，重復(fù)測量多因素方差分析提示時間和LPS對小鼠平臺定位潛伏期的影響具有統(tǒng)計學(xué)意義(Ftime=157.42，P=0.0001;FLPS=10.53，P=0.0017)。在第2天的訓(xùn)練中NC+LPS組小鼠找到平臺的過程較NC組明顯延長。而在第4天，NC組與其余7組相比均無統(tǒng)計學(xué)差異，結(jié)果提示通過4天的學(xué)習(xí)，各組小鼠均可成功地找到隱匿的平臺。(2)Morr

5、is水迷宮空間探索實驗結(jié)果顯示，NC+LPS組的小鼠在目標(biāo)象限停留時間比例較NC組明顯縮短;TSPOoe+LPS組的小鼠則較NC+LPS組明顯延長;而相較于TSPOoe+LPS組，TSPOoe+LPS+FN組小鼠的目標(biāo)象限停留時間比例明顯減少。(3) Western-blotting結(jié)果經(jīng)三因素方差分析顯示，微注射TSPOoe的小鼠海馬CA1區(qū)的TSPO表達(dá)量顯著提高。而經(jīng)LPS處理的小鼠海馬CA1區(qū)的TSPO的表達(dá)量亦明顯提高。(4)

6、微注射TSPOoe小鼠的海馬CA1區(qū)孕酮及四氫孕酮含量均顯著增加。非那雄胺對小鼠海馬CA1區(qū)的孕酮合成無顯著影響，但可顯著降低小鼠海馬CA1區(qū)四氫孕酮水平。
　　結(jié)論:TSPO在海馬CA1區(qū)的過表達(dá)可改善LPS導(dǎo)致的小鼠學(xué)習(xí)和記憶功能障礙。并增加小鼠海馬CA1區(qū)孕酮和四氫孕酮的含量，使用非那雄胺阻斷四氫孕酮的合成可部分反轉(zhuǎn)由TSPO過表達(dá)產(chǎn)生的腦保護(hù)效應(yīng)。實驗同時也提示，在神經(jīng)損傷中TSPO水平的上調(diào)可能是機(jī)體自身的適應(yīng)性保護(hù)作用

7、，這可能與機(jī)體需要更多的內(nèi)源性神經(jīng)甾體尤其是四氫孕酮有關(guān)。因此，我們認(rèn)為TSPO具有明確的腦損傷保護(hù)作用，可作為今后的臨床工作中一種有效的治療靶點(diǎn)。
　　第二部分 BV-2細(xì)胞的TSPO過表達(dá)對小鼠海馬原代神經(jīng)元損傷的保護(hù)作用及機(jī)制
　　目的:通過體外實驗來探討B(tài)V-2細(xì)胞TSPO過表達(dá)對神經(jīng)元的影響及作用機(jī)制。
　　方法:根據(jù)轉(zhuǎn)染BV-2細(xì)胞的慢病毒類型(NC或TSPOoe)以及是否給予LPS（100ng/ml）刺激

8、，將BV-2細(xì)胞分為四組:NC組、TSPOoe組、NC+LPS組及TSPOoe+LPS組，使用ELISA試劑盒測量BV-2細(xì)胞培養(yǎng)基中TNF-α及IL-6的含量。收集BV-2細(xì)胞的條件培養(yǎng)基(CM)作用于小鼠海馬原代神經(jīng)元。并根據(jù)BV-2細(xì)胞不同處理條件下產(chǎn)生的CM,將原代神經(jīng)元分成4組:NC-CM組、TSPOoe-CM組、NC+LPS-CM組及TSPOoe+LPS-CM組。使用CCK-8法檢測各組神經(jīng)元的活力。
　　結(jié)果:(1)

9、NC+LPS組細(xì)胞培養(yǎng)基中的TNF-α及IL-6含量較NC組均顯著增加，而TSPOoe+LPS組培養(yǎng)基中的TNF-α及IL-6含量較NC+LPS組均顯著降低。(2)CCK-8結(jié)果顯示:NC+LPS-CM組中小鼠海馬原代神經(jīng)元的活力明顯低于NC-CM組;而TSPOoe+LPS-CM組的原代神經(jīng)元活力較NC+LPS-CM組明顯增加。
　　結(jié)論:TSPO的過表達(dá)可減弱LPS誘導(dǎo)BV-2細(xì)胞合成TNF-α和IL-6的能力，具有明顯的抑制炎