TSPO配體PK11195對神經(jīng)炎癥的保護作用及機制探討.pdf

1、轉(zhuǎn)位蛋白18 kDa(TSPO)主要是在甾體合成的組織中表達。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，主要由腦內(nèi)的膠質(zhì)細(xì)胞表達。TSPO蛋白主要負(fù)責(zé)合成多種甾體激素的限速步驟，即膽固醇由線粒體外膜向內(nèi)膜的轉(zhuǎn)運。此外，TSPO還在調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)方面發(fā)揮著很重要的作用。在急性腦損傷和多種中樞神經(jīng)的退行性病變中均發(fā)現(xiàn)TSPO表達顯著增加。但TSPO蛋白表達的上調(diào)與神經(jīng)退行性疾病的發(fā)生其因果關(guān)系目前尚不完全明確。此外，TSPO配體也在神經(jīng)保護、神經(jīng)增生、焦慮等方面表現(xiàn)

2、出了治療作用。大量體內(nèi)及體外研究顯示TSPO經(jīng)典配體PK11195、Ro5-4864能減少小膠質(zhì)細(xì)胞活化，對神經(jīng)炎癥具有抑制作用。但目前有關(guān)TSPO配體與認(rèn)知功能和淀粉樣蛋白生成和累積關(guān)系的研究仍然較少。本實驗中，使用慢性脂多糖(LPS)腹腔注射制造小鼠神經(jīng)炎癥病理模型，該模型在許多研究中用來模擬AD的病理改變，包括中樞神經(jīng)炎癥、膠質(zhì)化、β-淀粉樣蛋白(Aβ)的累積及認(rèn)知損害。本研究通過在體和離體實驗探討了TSPO的經(jīng)典配體PK1119

3、5的抗炎、抗淀粉樣蛋白生成、神經(jīng)保護作用及可能機制。
　　第一部分 TSPO配體PK11195對脂多糖誘導(dǎo)的神經(jīng)炎癥的保護作用及機制探討
　　目的:探討TSPO配體PK11195對脂多糖誘導(dǎo)的小鼠神經(jīng)炎癥的保護及可能的發(fā)生機制。
　　方法:C57BL/6J小鼠按體重隨機分為Control組、LPS組、LPS+PK11195組和PK11195組。 LPS+PK11195組及PK11195組腹腔注射PK11195(3 mg

4、/Kg)。PK11195注射三天后開始注射LPS，兩種藥物均注射至實驗結(jié)束。LPS劑量為預(yù)實驗確定的劑量，PK11195劑量根據(jù)文獻確定。LPS注射七天后，將小鼠先進行為期四天的水迷宮訓(xùn)練，即隱蔽平臺訓(xùn)練，結(jié)束后進行一天的水迷宮測試，即水迷宮探索實驗。實驗結(jié)束后，取腦并使用Western-blotting法對海馬COX-2、BACE-1、IDE以及BDNF蛋白表達量進行檢測。使用ELISA法進行海馬組織Aβ蛋白、孕酮、四氫孕酮含量測定。

5、
　　結(jié)果:1.預(yù)實驗結(jié)果提示引起C57BL/6J小鼠認(rèn)知損害的最佳LPS劑量為500μg/Kg。2.水迷宮訓(xùn)練實驗中，隱蔽平臺訓(xùn)練結(jié)果顯示:在第一天訓(xùn)練中，LPS組的小鼠需要更長的時間才能定位平臺;在訓(xùn)練的第四天中，LPS組動物需要游動更長的距離才能定位平臺。在空間探索實驗里，LPS組的動物與對照組相比在水迷宮的原平臺所在的目標(biāo)象限中停留時間縮短，目標(biāo)象限游泳距離減少，PK11195預(yù)處理組預(yù)防了LPS導(dǎo)致的認(rèn)知損害。3.與對照

6、組相比，LPS使海馬炎癥蛋白TSPO、COX-2的表達增加，PK11195預(yù)處理使該效應(yīng)有所減弱。4.LPS顯著增加了海馬Aβx-42含量并伴隨BACE-1、IDE表達量的增加，PK11195預(yù)處理部分減輕了LPS導(dǎo)致的這種效應(yīng)。5.LPS使小鼠海馬孕酮水平降低，PK11195預(yù)處理使LPS處理后的小鼠腦內(nèi)孕酮和四氫孕酮的含量均有所升高。6.LPS顯著降低了BDNF的在海馬內(nèi)的表達量，而PK11195預(yù)處理對注射LPS誘導(dǎo)的BDNF表達

7、量并無顯著影響。
　　結(jié)論:PK11195可以對慢性LPS注射導(dǎo)致的認(rèn)知損害起保護作用?？赡艿臋C制包括減輕神經(jīng)炎癥及小膠質(zhì)細(xì)胞的激活，增加神經(jīng)甾體激素的合成，減少Aβ蛋白的累積，并伴有BACE-1的表達下調(diào)。
　　第二部分 PK11195對Aβ1-42形成的寡聚體導(dǎo)致BV-2細(xì)胞炎癥模型的保護作用及機制
　　目的:Aβ1-42寡聚體誘導(dǎo)BV-2激活作為炎癥細(xì)胞模型，探討TSPO經(jīng)典配體PK11195的對該模型的作用及機

8、制。
　　方法:首先使用Aβ1-42形成的寡聚體誘導(dǎo)BV-2細(xì)胞損傷模型，使用CCK-8試劑盒根據(jù)BV-2細(xì)胞存活率確定PK11195對Aβ1-42激活BV-2細(xì)胞模型保護作用的最佳濃度。并使用Western-blotting的方法確定Aβ1-42寡聚體、PK11195對BV-2細(xì)胞表達TSPO、COX-2及BACE-1蛋白的影響。
　　結(jié)果:1.使用CCK-8試劑盒根據(jù)BV-2細(xì)胞存活率確定Aβ1-4210μM作為建立BV

9、-2細(xì)胞損傷模型的劑量，作用時間選擇48 h。2.PK11195在0.01μM、0.1μM的濃度時對Aβ1-42損傷的BV-2細(xì)胞具有顯著地保護作用，其量效關(guān)系為倒U形曲線。3.Western-blotting結(jié)果顯示Aβ1-42(10μM)使BV-2細(xì)胞TSPO、COX-2蛋白表達量顯著升高，PK11195(0.1μM)則逆轉(zhuǎn)了Aβ1-42的該作用。4.Western-blotting結(jié)果顯示Aβ1-42(10μM)使BV-2細(xì)胞BA

10、CE-1蛋白表達量顯著升高，PK11195(0.1μM)則逆轉(zhuǎn)了Aβ1-42的該作用。
　　結(jié)論:我們的研究顯示小膠質(zhì)細(xì)胞的激活與Aβ蛋白導(dǎo)致的中樞神經(jīng)炎癥關(guān)系非常密切。Aβ蛋白激活BV-2細(xì)胞，使COX-2、TSPO表達增加，同時使BACE-1表達也增加、Aβ蛋白生成進一步增加，并形成惡性循環(huán)，并最終對BV-2細(xì)胞也造成損害。而TSPO配體PK11195可使BV-2細(xì)胞激活程度下降，產(chǎn)生的炎癥蛋白減少、BACE-1蛋白表達下降并