麥冬皂苷D通過CYP2J3-EETs系統(tǒng)發(fā)揮心肌保護(hù)作用的分子機(jī)制研究.pdf

1、目的：細(xì)胞色素P450酶中的CYP2J家族（人源為CYP2J2，鼠源為CYP2J3）廣泛分布于心血管系統(tǒng)、腎臟及肝臟，在心肌中的表達(dá)量最高，不僅參與外源性物質(zhì)的代謝，還主要參與內(nèi)源性物質(zhì)花生四烯酸（arachidonic acid, AA）的代謝，并生成四種環(huán)氧二十碳三烯酸（epoxyeicosatrienoic acids, EETs）代謝產(chǎn)物，包括5,6-EET、8,9-EET、11,12-EET、14,15-EET。EETs是一種

2、內(nèi)源性心血管活性物質(zhì)，具有抑制心肌肥大、凋亡，抗炎、抗氧化、抗心肌缺血、舒張血管、促進(jìn)心血管生成等廣泛的心肌保護(hù)作用。麥冬皂苷D（Ophiopogonin D, OPD）是臨床常用的治療心臟疾病的中藥復(fù)方參麥注射液中的主要有效成分之一，本實(shí)驗(yàn)室前期研究初步發(fā)現(xiàn) OPD能顯著誘導(dǎo)大鼠心肌細(xì)胞中 CYP2J3的基因表達(dá)。因此，本實(shí)驗(yàn)將進(jìn)一步確證 OPD對(duì) CYP2J3的表達(dá)及活性的影響；并從CYP2J3/EETs系統(tǒng)研究 OPD發(fā)揮心肌細(xì)胞

3、保護(hù)作用的分子機(jī)制，通過檢測 OPD對(duì)大鼠心肌細(xì)胞 H9c2內(nèi) Ca2+穩(wěn)態(tài)及細(xì)胞凋亡的影響；并進(jìn)一步探討 CYP2J3在OPD介導(dǎo)的心肌保護(hù)功能中發(fā)揮的作用，以期揭示 OPD的心肌保護(hù)作用及其藥理活性機(jī)制，為該藥的進(jìn)一步研究及臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。
　　方法：（1）用不同濃度 OPD分別處理大鼠心肌細(xì)胞，用 MTS檢測細(xì)胞存活率，并分別用qRT-PCR及Western-blot檢測CYP2J3的mRNA及蛋白表達(dá)，ELISA試劑

4、盒檢測AA代謝產(chǎn)物14,15-DHET(14,15-EET的穩(wěn)定代謝產(chǎn)物)的含量。（2）用慢病毒載體構(gòu)建CYP2J3穩(wěn)定過表達(dá)的H9c2細(xì)胞系，qRT-PCR及Western-blot分別檢測CYP2J3過表達(dá)或不同EETs處理下對(duì)H9c2內(nèi)鈣調(diào)蛋白mRNA和蛋白表達(dá)的影響。（3）siRNA敲低CYP2J3的表達(dá)，qRT-PCR及Western-blot檢測CYP2J3敲低前后 OPD對(duì) H9c2內(nèi)鈣調(diào)蛋白表達(dá)的影響；用 Fluo/4-

5、AM熒光探針標(biāo)記的H9c2細(xì)胞內(nèi) Ca2+，激光共聚焦顯微鏡檢測 CYP2J3敲低前后 OPD對(duì) H9c2胞內(nèi)Ca2+濃度影響的變化。（4）AngII、TG、TM誘發(fā)H9c2細(xì)胞內(nèi)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)及細(xì)胞凋亡，qRT-PCR及Western-blot檢測 OPD對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激及其介導(dǎo)的凋亡分子的影響，Hoechst33258染色及TUNEL凋亡試劑盒從形態(tài)學(xué)檢測OPD對(duì)AngII誘發(fā)的H9c2細(xì)胞凋亡的作用。
　　結(jié)果：（1）0～1μ

6、M OPD對(duì)H9c2細(xì)胞活力沒有影響，濃度在2.5μM及以上時(shí)，會(huì)對(duì)細(xì)胞有不同程度損傷。（2）OPD在低（100 nM）、中（250 nM）、高（500 nM）三個(gè)濃度作用于H9c2時(shí)，可濃度依賴性的誘導(dǎo)CYP2J3的mRNA及蛋白表達(dá)，并可增加其代謝產(chǎn)物14,15-DHET的含量。（3）CYP2J3過表達(dá)及不同 EETs處理 H9c2均可有效逆轉(zhuǎn) AngII所致的鈣調(diào)蛋白 SERCA2a、PLB、RyR2及FKBP12.6表達(dá)的下降。

7、（4）OPD可逆轉(zhuǎn)AngII所致的H9c2內(nèi)鈣調(diào)蛋白表達(dá)的下降及胞內(nèi) Ca2+滲漏，siRNA敲低 CYP2J3表達(dá)條件下，OPD對(duì)胞內(nèi) Ca2+穩(wěn)態(tài)的調(diào)節(jié)作用明顯降低。（5）OPD能有效抑制 AngII、TG、TM誘發(fā)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激及其相關(guān)凋亡分子的表達(dá)，并能減輕細(xì)胞凋亡。
　　結(jié)論：首次研究發(fā)現(xiàn)并證明了 OPD可誘導(dǎo)細(xì)胞色素 P450酶 CYP2J3的表達(dá)及其代謝產(chǎn)物EETs的含量；且OPD對(duì)大鼠心肌細(xì)胞內(nèi)的Ca2+穩(wěn)態(tài)的調(diào)節(jié)作