鐵蛋白基因在骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成神經(jīng)分化中的可誘導(dǎo)表達(dá)及MR成像.pdf

1、背景與目的:
　　細(xì)胞活體示蹤是分子影像學(xué)領(lǐng)域的重要內(nèi)容之一，用于示蹤移植細(xì)胞的方法主要有磁標(biāo)記和報(bào)告基因成像兩種，其中以后者更具優(yōu)勢(shì)。鐵蛋白基因（FTH1）作為一種較為成熟的MRI報(bào)告基因已成功用于多種類型細(xì)胞的示蹤研究。目前多數(shù)研究結(jié)果顯示，由于FTH1基因整合到細(xì)胞的基因組，其表達(dá)不受細(xì)胞分裂增殖的影響，但是否受干細(xì)胞誘導(dǎo)分化的影響目前尚不明確。本研究通過(guò)構(gòu)建攜帶FTH1基因的慢病毒載體，感染骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（mesench

2、ymal stem cells,MSCs），將MSCs向神經(jīng)元樣細(xì)胞誘導(dǎo)分化，并檢測(cè)MSCs成神經(jīng)分化前后的FTH1表達(dá)情況，探討FTH1基因表達(dá)對(duì)干細(xì)胞成神經(jīng)分化的影響，以及成神經(jīng)分化對(duì)FTH1基因表達(dá)的影響，明確FTH1在神經(jīng)元樣細(xì)胞內(nèi)的聚鐵能力是否能夠引起足夠的MRI信號(hào)改變，為進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)體內(nèi)干細(xì)胞神經(jīng)分化的MRI活體示蹤奠定基礎(chǔ)。
　　方法:
　　1.攜載Tet-on可調(diào)控FTH1基因的慢病毒載體構(gòu)建及病毒包裝

3、>　　合成 FTH1基因并插入到Tet-on可誘導(dǎo)表達(dá)慢病毒載體上，重組攜載可調(diào)控FTH1基因慢病毒質(zhì)粒（pLV-Tet-FTH1），PCR及DNA測(cè)序鑒定。再將pLV-Tet-FTH1載體質(zhì)粒和包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293 T細(xì)胞，生產(chǎn)慢病毒（LV-Tet-FTH1）并測(cè)定滴度。
　　2.攜載Tet-on可調(diào)控FTH1基因的MSCs（MSCs-Tet-FTH1）建立
　　以LV-Tet-FTH1轉(zhuǎn)染MSCs，構(gòu)建含有可調(diào)控FTH1

4、報(bào)告基因的MSCs（MSCs-Tet-FTH1），嘌呤霉素篩選。
　　3.FTH1在 MSCs-Tet-FTH1細(xì)胞的可誘導(dǎo)表達(dá)及聚鐵效應(yīng)
　　在MSCs-Tet-FTH1的完全培養(yǎng)基內(nèi)加入梯度濃度的誘導(dǎo)劑(DOX)進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，經(jīng)過(guò)一定時(shí)間后采用蛋白質(zhì)印跡法(Western Blot)檢測(cè)FTH1基因表達(dá)產(chǎn)物鐵蛋白，確定DOX最佳濃度和最佳時(shí)間。CCK-8試劑檢測(cè)病毒轉(zhuǎn)染和枸櫞酸鐵銨(FAC)對(duì)細(xì)胞增殖活性的影響，普魯士藍(lán)

5、染色和電鏡觀察MSCs-Tet-FTH1細(xì)胞的轉(zhuǎn)鐵效應(yīng)，磁共振觀察細(xì)胞內(nèi)FTH1基因表達(dá)是否引起T2WI信號(hào)變化。
　　4.MSCs成神經(jīng)誘導(dǎo)分化和鑒定
　　采用全反式維甲酸和 MNM神經(jīng)誘導(dǎo)液誘導(dǎo)細(xì)胞成神經(jīng)分化，觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化，同時(shí)檢測(cè)神經(jīng)元特異性表面標(biāo)志物神經(jīng)元特異性烯醇化酶（NSE）、巢蛋白（Nestin）和微管蛋白-2（MAP-2）。
　　5.誘導(dǎo)分化后FTH1基因表達(dá)及聚鐵能力的檢測(cè)
　　MSCs成

6、神經(jīng)誘導(dǎo)分化后，Western Blot檢測(cè)基因表達(dá)產(chǎn)物鐵蛋白，普魯士藍(lán)色和透射電鏡檢測(cè)基因表達(dá)產(chǎn)物的聚鐵能力，磁共振檢測(cè)T2WI信號(hào)變化。
　　結(jié)果:
　　1.攜載FTH1基因的可調(diào)控Tet-on慢病毒載體重組、病毒包裝和滴度測(cè)定
　　利用DNA測(cè)序、基因重組等技術(shù)證實(shí)已成功構(gòu)建Tet-on可調(diào)控FTH1基因表達(dá)的慢病毒載體系統(tǒng)，再進(jìn)行慢病毒包裝，得到病毒，檢測(cè)其滴度為1×109 TfU/ml。
　　2.攜載T

7、et-on可調(diào)控FTH1基因的慢病毒對(duì)MSCs的轉(zhuǎn)染及篩選
　　成功建立并篩選出轉(zhuǎn)染FTH1基因的MSCs（MSCs-Tet-FTH1），Western Blot檢測(cè)到FTH1基因表達(dá)產(chǎn)物的表達(dá)。
　　3.MSCs-Tet-FTH1細(xì)胞內(nèi)FTH1基因的可誘導(dǎo)表達(dá)及其聚鐵效應(yīng)
　　Western Blot結(jié)果顯示，F(xiàn)TH1基因表達(dá)產(chǎn)物與誘導(dǎo)劑DOX存在量-濃度和量-時(shí)間依賴關(guān)系。1μg/ml的DOX誘導(dǎo)3 d后，F(xiàn)TH1

8、基因的表達(dá)產(chǎn)物量達(dá)到峰值。
　　在完全培養(yǎng)基內(nèi)添加一定濃度DOX和枸櫞酸鐵銨時(shí)，細(xì)胞可從周圍攝取鐵。3.0 T磁共振掃描顯示：MSCs-Tet-FTH1細(xì)胞在T2WI信號(hào)明顯降低，對(duì)照組MSCs信號(hào)未見(jiàn)降低。普魯士藍(lán)染色和電鏡顯示：添加1μg/mlDOX和500μM FAC后，MSCs-Tet-FTH1細(xì)胞內(nèi)見(jiàn)大量鐵顆粒，而對(duì)照組僅見(jiàn)部分細(xì)胞內(nèi)有少許鐵顆粒。
　　4.MSCs-Tet-FTH1成神經(jīng)誘導(dǎo)分化及鑒定
　　

9、MSCs在全反式維甲酸（ATRA）預(yù)誘導(dǎo)24 h，再用MNM成神經(jīng)誘導(dǎo)液誘導(dǎo)分化24 h后，細(xì)胞形態(tài)發(fā)生明顯變化，呈典型神經(jīng)元形態(tài)，特異標(biāo)志物NSE、Nestin、MAP-2均呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞MSCs-Tet-FTH1經(jīng)相同方法誘導(dǎo)分化后亦檢測(cè)到上述變化。說(shuō)明轉(zhuǎn)染病毒對(duì)MSCs的誘導(dǎo)分化能力沒(méi)有明顯影響。
　　5 MSCs-Tet-FTH1誘導(dǎo)分化后的FTH1基因表達(dá)及聚鐵能力
　　MSCs-Tet-FTH1成神經(jīng)誘

10、導(dǎo)分化后，Western Blot檢測(cè)：Neurons-Tet-FTH1內(nèi)鐵蛋白仍有大量表達(dá)，普魯士藍(lán)染色觀察到細(xì)胞內(nèi)有大量藍(lán)色鐵染顆粒，透射電鏡亦檢測(cè)到有大量黑色致密顆粒。MRI顯示誘導(dǎo)分化后細(xì)胞仍能引起T2WI信號(hào)顯著降低。
　　結(jié)論:
　　成功將含有FTH1基因的MSCs（MSCs-Tet-FTH1）誘導(dǎo)分化為神經(jīng)元樣細(xì)胞Neurons-Tet-FTH1，明確了成神經(jīng)誘導(dǎo)分化不影響MSCs細(xì)胞內(nèi)FTH1基因的表達(dá)，基于