人源化AGR2單抗的瞬時表達及初步成藥性評價.pdf

1、Anterior gradient-2（AGR2）是從乳腺癌細胞MCF-7的cDNA文庫中篩選出的非洲爪蟾XAG2（Xenopus anterior gradient-2）的同源基因，在腫瘤生長、轉(zhuǎn)移、侵潤及耐藥性等方面有重要作用。rhAGR2-mAb是以 AGR2為靶標的人源化單克隆抗體，rhAGR2-mAb單抗通過結(jié)合 AGR2蛋白分子上獨特的不連續(xù)位點從而阻斷 AGR2的功能，進而達到抑制腫瘤細胞的增殖和遷移的目的。本研究通過瞬時

2、轉(zhuǎn)染HEK293F細胞表達rhAGR2-mAb并純化獲得重組蛋白抗體，比較HEK293F細胞與CHO細胞表達的rhAGR2-mAb在分子量、等電點、親和力和糖基化等方面的異同，以及進行 rhAGR2-mAb急性毒性實驗與藥代動力學實驗初步成藥性評價，為rhAGR2-mAb的進一步研究與開發(fā)奠定基礎(chǔ)。
　　本研究采用聚乙烯亞胺介導轉(zhuǎn)染HEK293F細胞表達rhAGR2-mAb，通過正交試驗得出在5mL體系中HEK293F細胞瞬時表達

3、rhAGR2-mAb的最佳條件是：細胞密度為6×106cells/mL，DNA濃度為0.5μg/106 cells，DNA:PEI為1:4，LC％為50%。且以此條件線性放大到30mL、100mL培養(yǎng)體積中，蛋白產(chǎn)量無明顯損失，但在350mL培養(yǎng)體積時表達量有一定下降。細胞培養(yǎng)液經(jīng)Protein A親和層析柱一步純化可得純度達95%以上，純化產(chǎn)物對MCF-7細胞的增殖有較明顯的抑制作用。比較HEK293F細胞與CHO細胞表達的rhAGR

4、2-mAb發(fā)現(xiàn)，不同宿主細胞表達的抗體蛋白在分子量、等電點、糖型種類方面無明顯差異，但兩者親和力和糖型的比例有較大差異。
　　本研究設(shè)置小鼠急性毒性試驗進行100mg/kg rhAGR2-mAb腹腔給藥，從軀體運動系統(tǒng)、自主神經(jīng)系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)、胃腸道系統(tǒng)、泌尿生殖系統(tǒng)、皮膚和被毛、黏膜、眼等指標觀察動物反應(yīng)，并通過HE切片染色觀察其對心、肝、脾、肺、腎等主要器官的影響，給藥后1周內(nèi)，均未見明顯異常，且小鼠體重與溶劑對照組相比沒有顯

5、著性差異。即 rhAGR2-mAb對小鼠的急性毒性最小致死劑量（MLD）大于100mg/kg。此外，本研究進行了rhAGR2-mAb的大鼠藥代動力學研究，建立了ELISA的方法檢測大鼠血清中rhAGR2-mAb的含量，在檢測范圍、靈敏度、回收率、特異性、精密度以及準確度上均滿足動物藥代動力學研究的要求。對大鼠進行5.6mg/kg腹腔給藥，檢測大鼠的血藥濃度得出rhAGR2-mAb的半衰期約為11天，AUC0-∞為（30001.95±99