苦參堿對(duì)大腸埃希菌外膜蛋白A表達(dá)量影響的作用研究.pdf

1、第一部分不同抑菌濃度苦參堿對(duì)大腸埃希菌外膜蛋白A表達(dá)量的影響
　　目的:
　　本實(shí)驗(yàn)采用LB肉湯—腹膜透析外接硅膠管系統(tǒng)建立大腸埃希菌體外細(xì)菌生物膜模型，探討在大腸埃希菌生物膜早、中、晚期，不同抑菌濃度的苦參堿對(duì)大腸埃希菌外膜蛋白A(ompA)表達(dá)量的影響。
　　方法:
　　用二倍稀釋法分別測(cè)量苦參堿和左氧氟沙星對(duì)大腸埃希菌的最低抑菌濃度(MIC)。將經(jīng)過(guò)高壓蒸汽滅菌的腹膜透析管載體置入無(wú)菌的24孔板中，隨機(jī)分為

2、6組:空白對(duì)照組（陰性對(duì)照組）、1/2MIC左氧氟沙星組（陽(yáng)性對(duì)照組）、1/2MIC苦參堿組、1/4MIC苦參堿組、1/8MIC苦參堿組、1/16MIC苦參堿組。從開(kāi)始建立大腸埃希菌生物膜模型時(shí)，就將藥物加入藥物干預(yù)組調(diào)成相應(yīng)的藥物濃度。于生物膜早（1天）、中（3天）、晚(7天)期，分別利用細(xì)菌蛋白抽提試劑提取24孔板中細(xì)菌總蛋白，通過(guò)蛋白質(zhì)印跡法(Western blot)檢測(cè)不同時(shí)間、不同藥物及濃度下大腸埃希菌外膜蛋白A(ompA)

3、的表達(dá)量。
　　結(jié)果:
　　在不同藥物抑菌濃度的干預(yù)下，1/2MIC苦參堿組、1/4MIC苦參堿組、1/8MIC苦參堿組、1/16MIC苦參堿組及1/2MIC左氧氟沙星組與空白對(duì)照組相比較，無(wú)論在生物膜早（1天）、中（3天）、晚（7天）期，大腸埃希菌外膜蛋白A(ompA)的表達(dá)量均減少(P＜0.05)，且不同濃度苦參堿組之間對(duì)ompA蛋白表達(dá)量的影響統(tǒng)計(jì)學(xué)無(wú)明顯差異（P＞0.05）。
　　結(jié)論:
　　1/2MIC

4、苦參堿組、1/4MIC苦參堿組、1/8MIC苦參堿組、1/16MIC苦參堿組及1/2MIC左氧氟沙星組在大腸埃希菌生物膜早、中、晚期均能抑制其外膜蛋白A(ompA)的表達(dá)。
　　第二部分大腸埃希茵OmpA蛋白原核表達(dá)載體的構(gòu)建
　　目的:
　　對(duì)大腸埃希菌的外膜蛋白A基因（ompA）進(jìn)行克隆，鑒定，構(gòu)建原核基因表達(dá)載體，為構(gòu)建OmpA過(guò)表達(dá)菌株奠定基礎(chǔ)。
　　方法:
　　以大腸埃希菌K12菌株基因組DNA為

5、模板，用PCR法擴(kuò)增基因ompA，接著用酶切、連接、轉(zhuǎn)化等系列方法，將此基因克隆到原核表達(dá)載體pET-32a(+)中構(gòu)建重組質(zhì)粒ompA-pET-32a，并通過(guò)PCR進(jìn)行驗(yàn)證，將初步驗(yàn)證正確的重組質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序鑒定。將鑒定正確的重組體轉(zhuǎn)化入表達(dá)宿主Ecoli Rosetta菌株內(nèi)，為后續(xù)對(duì)轉(zhuǎn)化菌株Rosetta以IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)做準(zhǔn)備。
　　結(jié)果:
　　經(jīng)PCR鑒定、DNA測(cè)序驗(yàn)證構(gòu)建的重組質(zhì)粒，證實(shí)ompA基因正確地插入到p