新型雷帕霉素微粒釋藥系統(tǒng)的構建及其抗動脈粥樣硬化作用研究.pdf

1、心血管疾病(Cardiovascular disease，CVD)是導致人類死亡和勞動力喪失的重要因素，其發(fā)病率和死亡率已經(jīng)超越腫瘤位居第一。動脈粥樣硬化(Atherosclerosis，AS)是引起冠狀動脈疾病、中風等多種心血管疾病的共同的病理基礎，是當前人類需要攻克的一大難題。AS的發(fā)病機制較為復雜，致病因素較多，目前以他汀類為代表的降脂藥物被廣泛應用于臨床治療，盡管取得了一定效果，但是CVD的發(fā)病率和致死率依然逐年上升，同時長期給

2、藥帶來的不良反應也對患者造成較大困擾，因此尋找有效的治療藥物、構建適宜的藥物遞送系統(tǒng)對于防治CVD具有重要意義。
　　雷帕霉素(Rapamycin，RAP)因具有良好的抗增殖活性被廣泛用于器官移植后抗排斥反應和抑制冠狀動脈支架植入術后再狹窄。RAP的靶點為哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(Mammalian Target of Rapamycin，mTOR)，它是調節(jié)細胞內脂質、蛋白、能量水平的重要因子。通過調節(jié)mTOR信號通路，RAP具有

3、抗炎、抑制平滑肌細胞增生、遷移和促進自噬選擇性殺滅巨噬細胞等多重作用，因而具有潛在的抗AS作用。目前對于RAP在動物體內抗AS作用還不明確，其AS防治作用有待進一步確證。另一方面，RAP較強的疏水性導致其傳統(tǒng)劑型給藥后生物利用度低，不利于其療效的發(fā)揮。同時，RAP的傳統(tǒng)劑型在釋放時間和釋放位點兩個方面的控制均不理想，限制了其療效的發(fā)揮，亦會帶來較大的不良反應。因而，構建適用于不同給藥途徑的、具有良好臨床應用前景的新型RAP釋藥系統(tǒng)，對于

4、發(fā)揮RAP的有效活性意義重大。
　　目的：
　　構建不同的RAP微粒釋藥系統(tǒng)，以為其療效的最大化發(fā)揮提供潛在的新型藥物制劑。為此，首先在小鼠體內評價了RAP的抗AS作用;然后，通過主-客體作用介導的自組裝方法構建了RAP口服微粒系統(tǒng)，通過縮醛化β-環(huán)糊精材料構建了適用于局部注射給藥的RAP緩釋微粒，并通過具有病灶微環(huán)境響應性的功能化β-環(huán)糊精材料構建了靶向性RAP納米釋藥系統(tǒng)。與傳統(tǒng)的RAP制劑相比，這些不同的釋藥系統(tǒng)各具優(yōu)

5、勢，并能更好地發(fā)揮RAP的抗AS作用，為其臨床防治AS的應用奠定了堅實的基礎，同時也為RAP的臨床應用提供了多種新型的候選劑型。
　　方法：
　　1.載體材料的合成
　　1.1.聚(N-異丙基丙烯酰胺)(PNIPAm)的合成
　　1.2.縮醛化β-環(huán)糊精(Ac-bCD)的合成
　　1.3.氧化響應性β-CD(Ox-bCD)的合成
　　上述制備的材料均通過氫核磁共振光譜法(1H NMR)和傅立葉變換紅外

6、光譜法(FTIR)確證其結構，凝膠滲透色譜法(GPC)測定分子量。
　　2.載藥微粒的制備
　　2.1.口服微粒系統(tǒng)的制備
　　2.2.RAP緩釋微粒的制備
　　2.3.響應性RAP載藥納米粒的制備
　　3.載藥微粒的表征
　　稱取少量樣本分散于水中，吸取足量混懸液滴于銅網(wǎng)膜和云母片上，室溫揮干，分別進行透射電鏡(TEM)和掃描電鏡(SEM)觀察。將剩余混懸液稀釋后加入比色杯中，通過動態(tài)光散射法測定樣

7、品的粒徑大小及其分布。另稱取少量樣本溶于DMSO中，紫外分光光度計法(UV)或液相色譜法(HPLC)測定RAP的含量，計算其載藥量和包封率。
　　4.藥物與載體材料間分子作用力的研究
　　通過計算模擬分析RAP與載體材料PNIPAm間的相互作用，采用MOE軟件生成RAP、PNIPAm三維構象，從Zinc數(shù)據(jù)庫中下載得到IND構象，應用MMFF94x力場進行能量最小化分析，采用Autodock對PNIPAm、RAP、IND和水

8、分子之間的相互作用力進行兩兩或者多分子對接，采用LGA算法計算分子間結合能大小。
　　5.RAP載藥微粒的體外釋放動力學研究
　　稱取適量載藥微?；鞈矣诓煌琾H值的PBS或含有H2O2的PBS中，置于37℃孵箱中，不同時間點離心后取出部分釋放液，再分散后加入同等體積的新鮮溶液。測定藥物濃度，Origin軟件繪制藥物累積釋放曲線。
　　6.載藥微粒的體內藥動學研究
　　7.AS模型的建立及不同治療方案
　　8

9、.主動脈斑塊面積分析
　　9.主動脈切片的組化分析
　　10.小鼠血清中炎癥因子的測定
　　11.RAP對mTOR信號通路的作用研究
　　12.主動脈組織ROS水平的測定
　　13.響應性納米粒靶向AS斑塊的評價
　　14.微粒釋藥系統(tǒng)的初步安全性評價
　　結果：
　　1.通過自由基聚合合成了PNIPAm，GPC測得其分子量為53973。采用MP為縮醛化試劑，通過動力學控制的縮醛化反應成功

10、合成了縮醛化β-CD(Ac-bCD)，其中線性與環(huán)狀縮醛基團的摩爾比為0.62∶1;通過將PBAP化學鍵合于β-CD，制備得到了氧化響應性的β-CD材料(Ox-bCD)，其中每個β-CD單元含有11個PBAP單元。
　　2.基于IND或SUL介導的PNIPAm的自組裝成功將RAP負載于微粒中，得到平均粒徑在600-800 nm的載藥微粒;其載藥量隨著投藥比的增加而升高，最高接近60％;通過乳化法制備的PLGA和Sl00載藥微粒，平

11、均粒徑在600 nm，其RAP載藥量分別為18.1％和17.2％。分子間動力學模擬結果表明RAP、IND、PNIPAm之間存在疏水作用，氫鍵作用、范德華力和靜電作用，因此能夠克服RAP分子間自身的結晶力，使RAP以無定型的形式被包裹于聚合物中，從而更有利于藥物的溶出，提高其體內生物利用度。
　　3.采用水包油乳化法成功將RAP包裹于Ac-bCD微粒中得到RAP-NP，其平均粒徑為250nm，載藥量27.2％，SEM和TEM觀察表明

12、RAP-NP呈規(guī)則球狀，且分散均勻。
　　4.以PLGA、Ac-bCD和Ox-bCD分別為疏水載體材料，采用納米沉淀-自組裝法成功制備得到具有不同響應性的RAP納米粒，即RAP/PLGA NP、RAP/Ac-bCD NP和RAP/Ox-bCD NP，三種納米粒的平均粒徑均在250nm左右，載藥量分別為8.0％、12.5％和7.0％，SEM和TEM觀察表明，納米粒均呈規(guī)則球形、分散均勻。
　　5.體外釋放實驗表明，在pH7.4

13、的PBS中，載RAP的PLGA和S100微粒24小時藥物累積量為50％，而自組裝RAP/PNIPAm微粒同時間段的釋放量為70％。體內藥動學研究表明，自組裝RAP微粒組具有顯著增加的口服生物利用度，其血藥濃度-時間曲線下面積(AUC)是PLGA和S100微粒的2倍。
　　6.在pH7.4的PBS中，RAP-NP能夠持續(xù)釋放32天，且是要速率較為恒定;在小鼠體內，RAP-NP皮下注射后可持續(xù)釋放22天，其血藥濃度長時間維持在50 n

14、g/L。與此對應，小鼠皮下注射RAP-NP能夠長時間保持主動脈組織中RAP的濃度在1.2ng/g。
　　7.PAP/Ac-bCD NP的釋放具有明顯的pH依賴性，其在pH5的釋放速率顯著快于pH7.4對應的釋放速率。另一方面，PBS中加入1 mM H2O2能夠顯著加速RAP/Ox-bCD NP的釋藥，表明其具有較好的氧化響應性。微酸性條件和H2O2的存在對RAP/PLGA NP的體外釋放無明顯影響。
　　8.ApoE/-小鼠

15、高脂喂養(yǎng)三個月后，對照組主動脈竇附近能夠形成肉眼可見的白色斑塊，表明AS模型建立成功。與對照組相比，RAP原料藥能夠明顯抑制AS斑塊的生長，降低斑塊內巨噬細胞和基質金屬蛋白酶-9(MMP-9)的水平、升高斑塊外周膠原含量，從而提高斑塊穩(wěn)定性。
　　結論：
　　1.口服后，高劑量的RAP原料藥能夠有效抑制ApoE-/-小鼠AS斑塊的生長、提高斑塊的穩(wěn)定性，表現(xiàn)在主動脈斑塊面積的減小、斑塊內巨噬細胞和MMP-9水平的降低、以及斑

16、塊外周膠原含量的升高。
　　2.通過含羧基小分子化合物介導的PNIPAm的自組裝，可以制備RAP載藥微粒，實現(xiàn)RAP的高效負載;同時因各分子間作用力大于藥物分子結晶力，使得RAP分子以無定形狀態(tài)包裹于微粒中，因而具有良好的藥物溶出度，口服給藥后比對照微粒系統(tǒng)具有更高的生物利用度。與此對應，自組裝RAP微粒比同劑量的PLGA和S100微粒具有更有效的抗AS作用。因此，自組裝RAP微粒有望為RAP的臨床應用提供一種理想的口服制劑。

17、r>　　3.通過縮醛化反應成功制備了新型載體材料Ac-bCD，采用水包油乳化法制備得到具備優(yōu)越緩釋性能的RAP-NP，它能維持血藥濃度長時間穩(wěn)定在較低水平，在這種藥物作用方式下RAP-NP能夠選擇性抑制mTORC1;原料藥因其較高的血藥濃度能夠同時抑制mTORC1和mTORC2信號通路。與口服RAP原料藥相比，RAP-NP緩釋微粒具有更加優(yōu)異的抗AS作用。
　　4.通過將氧化敏感性的基團化學鍵合于β-CD成功制備了新型氧化敏感性載