吳茱萸堿對(duì)阿爾茨海默病模型大鼠HMGB1-TLR4-NF-κB信號(hào)通路的研究.pdf

1、目的:阿爾茲海默病(Alzheimer's disease，AD)是一種漸進(jìn)性神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，以漸進(jìn)性記憶認(rèn)知障礙、情感性格及行為改變等為主要的臨床表現(xiàn)，其病因及發(fā)病機(jī)制不詳，已成為第四大死亡原因，其發(fā)病率及死亡率逐年增高，ADI(Alzheimer's Disease International，ADI)預(yù)測(cè)2040年我國(guó)癡呆患病率將以336％比例增長(zhǎng)，中國(guó)的癡呆病人數(shù)將等于世界發(fā)達(dá)國(guó)家癡呆數(shù)的總和（超過2000萬）。由此，AD的

2、預(yù)防和治療已經(jīng)成為世界各國(guó)研究的熱點(diǎn)課題。
　　目前有幾個(gè)不同的學(xué)說試圖闡明其病因:膽堿能性假說(Cholinergichypothesis)[8]，淀粉樣蛋白質(zhì)假說(Amyloid hypothesis)[9]及微管相關(guān)蛋白質(zhì)假說(Tau hypothesis)[10]等。隨著研究的深入，多數(shù)學(xué)者認(rèn)為，Aβ沉積誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)是導(dǎo)致AD發(fā)病的主要機(jī)制。如何減輕炎癥損傷成為治療AD的一條重要途徑。
　　HMGB1最初被認(rèn)為是一

3、種高度保守的核DNA結(jié)合蛋白，參與基因表達(dá)過程中DNA復(fù)制，修復(fù)及轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié)。但是，一旦細(xì)胞發(fā)生損傷或凋亡，本在胞核中的HMGB1轉(zhuǎn)移到胞漿或/和細(xì)胞外。近年來，HMGB1普遍被認(rèn)為是一種在細(xì)胞外參與細(xì)胞活化及促炎因子的釋放過程中的重要細(xì)胞因子。HMGB1自身可能通過RAGE(advanced glycationend products)受體和toll樣受體如TLR2及TLR4的活化完成信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程。這些受體的活化導(dǎo)致NF-κB（nuc

4、lear factor-κB）的活化，活化的NF-κB誘導(dǎo)造血細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞中白細(xì)胞粘附因子的上調(diào)。由此，HMGB1促進(jìn)了炎癥的發(fā)生，發(fā)展。
　　吳茱萸堿(Evodiamine)來源于蕓香科植物吳茱萸的干燥近成熟果實(shí)，具有抑制腫瘤止痛降低血壓抗炎等作用。對(duì)于的治療，研究發(fā)現(xiàn)吳茱萸堿能夠改善阿爾茨海默病的認(rèn)知功能，是一種具有抗炎生物活性的生物堿是核轉(zhuǎn)錄因子-κB(NF-κB)的抑制劑，從而抑制COX-2的mRNA的轉(zhuǎn)錄，從而抑制炎癥

5、反應(yīng)的發(fā)生、發(fā)展及惡化。吳茱萸堿能否通過下調(diào)HMGB1，TLR4及NF-κB的表達(dá)從而產(chǎn)生神經(jīng)保護(hù)作用有待進(jìn)一步的研究。本實(shí)驗(yàn)通過向SD大鼠雙側(cè)海馬區(qū)注射Aβ1-42建立阿爾茨海默病模型，觀察大鼠行為學(xué)改變以及HMGB1，TLR4及NF-κB蛋白在大鼠海馬組織中的表達(dá)情況，探討AD的發(fā)病機(jī)制及吳茱萸堿的腦保護(hù)作用及可能的機(jī)制。
　　方法:成年健康清潔級(jí)雄性SD大鼠32只，體重250±50g，按照隨機(jī)數(shù)字表法，分為假手術(shù)組(Sham

6、組)、假手術(shù)+吳茱萸堿組、AD模型組、AD+吳茱萸堿組，每組8只。適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后藥物干預(yù)組采用灌胃的方式按100mg/kg給予吳茱萸堿，喂養(yǎng)3周，每日一次，而AD模型組和Sham組給予等體積的生理鹽水。三周后通運(yùn)用腦立體定位儀將10μg凝聚態(tài)Aβ1-42注入雙側(cè)大鼠海馬區(qū)，從而建立AD動(dòng)物模型。造模后持續(xù)給予藥物及生理鹽水干預(yù)。造模1周后通過歷時(shí)5天的Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)，評(píng)估大鼠學(xué)習(xí)記憶力的改變水平，處死動(dòng)物后運(yùn)用HE染色法觀察實(shí)

7、驗(yàn)大鼠海馬CA1區(qū)錐體細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化，運(yùn)用免疫組織化學(xué)法觀察大鼠海馬區(qū)小膠質(zhì)細(xì)胞的活化水平及HMGB1，TLR4及NF-κB蛋白的表達(dá)水平，免疫印記(Western Blot)法測(cè)定HMGB1，TLR4及NF-κB蛋白的表達(dá)水平。
　　結(jié)果:
　　1 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn):各組大鼠逃避潛伏期不同(F=38.432，P＜0.05)，穿越平臺(tái)次數(shù)不同(F=4.388，P＜0.05)。AD組大鼠與Sham組相比，逃避潛伏期明顯

8、延長(zhǎng)、穿越平臺(tái)次數(shù)明顯減少（P值均＜0.05）。AD+吳茱萸堿組與AD組相比逃避潛伏期明顯縮短，穿越平臺(tái)次數(shù)明顯增加（P＜0.05）。
　　2 HE染色:Sham組海馬CA1區(qū)錐體細(xì)胞排列整齊，分布均勻，形態(tài)結(jié)構(gòu)正常，數(shù)量多;AD組海馬CA1區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞排列稀疏，結(jié)構(gòu)紊亂，數(shù)量明顯減少;AD+吳茱萸堿組與AD組相比，實(shí)驗(yàn)大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元數(shù)量、形態(tài)和結(jié)構(gòu)均有不同程度的恢復(fù)一神經(jīng)元數(shù)量增多，排列較整齊，結(jié)構(gòu)較致密，分布較均勻。<

9、br>　　3吳茱萸堿對(duì)HMGB1，TLR4及NF-κB表達(dá)水平的影響:在AD組，HMGB1，TLR4及NF-κB的蛋白表達(dá)水平及陽性細(xì)胞數(shù)目較Sham組明顯增多(P＜0.05);吳茱萸堿干預(yù)后，HMGB1，TLR4及NF-κB的蛋白表達(dá)水平及陽性細(xì)胞數(shù)目明顯下降，與AD組相比結(jié)果有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　結(jié)論:
　　1通過向大鼠雙側(cè)海馬區(qū)注射凝聚態(tài)Aβ1-42，成功建立了大鼠AD模型。
　　2 AD模型組大鼠