京尼平苷對巨噬細(xì)胞上清液刺激RSC-364細(xì)胞的影響及作用機(jī)制的研究.pdf

1、目的:類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種廣泛分布于全身的，以手、腕部小關(guān)節(jié)多發(fā)的自身免疫性疾病，其錯綜復(fù)雜的病因和發(fā)病機(jī)理迄今為止仍未完全探明。該病遍布世界各地，各個種族均有發(fā)病，世界平均患病率為1～1.5％，我國患病率為0.34％～0.36％，以女性多發(fā)，男女比例1∶3，本病在任何年齡段均可出現(xiàn)，以30至50歲發(fā)病最為常見。隨著病程的發(fā)展，致殘率不斷增加，已成為導(dǎo)致我國青壯年勞動力喪失的主要疾病之一。

2、RA的傳統(tǒng)治療藥物主要包括非甾體類抗炎藥、糖皮質(zhì)激素類藥物和改善病情的抗風(fēng)濕藥三大類，這些藥物主要用于控制和緩解疾病癥狀，長期用藥會產(chǎn)生嚴(yán)重的不良反應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)室研究報道，梔子及其單體京尼平苷(geniposide，Ge)能夠顯著抑制CIA大鼠血清中的致炎細(xì)胞因子IL-1β和TNF-α水平，Ge可以通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡從而抑制CIA大鼠滑膜細(xì)胞增殖。巨噬細(xì)胞可通過分泌多種炎癥介質(zhì)、基質(zhì)金屬蛋白酶、細(xì)胞因子和生長因子等在RA關(guān)節(jié)破壞中發(fā)揮著重要

3、的作用。京尼平苷屬于環(huán)烯醚萜苷類化合物，又名梔子苷，主要存在于梔子、杜仲等中藥植物中，其主要作用為抗炎、抗腫瘤、抗血栓、保護(hù)神經(jīng)元，此外對于骨質(zhì)疏松的治療也有一定的療效。本實(shí)驗(yàn)采用佛波酯(phorbol myristate acetate，PMA)誘導(dǎo)單核THP-1細(xì)胞分化為巨噬細(xì)胞，在脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）的刺激下，巨噬細(xì)胞培養(yǎng)上清液造成滑膜細(xì)胞RSC-364炎癥模型后，加入不同濃度的京尼平苷，研究京尼

4、平苷對巨噬細(xì)胞上清液刺激后RSC-364細(xì)胞及其信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的影響，以便進(jìn)一步對該藥物的特性和機(jī)理進(jìn)行探討和說明。
　　方法:
　　1、佛波酯(phorbol myristate acetate，PMA)誘導(dǎo)單核細(xì)胞THP-1分化為巨噬細(xì)胞后，加入脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)刺激獲取培養(yǎng)上清液。
　　2、將大鼠滑膜細(xì)胞RSC-364分為對照（培養(yǎng)基）組，模型（上清液）組，甲氨蝶呤(methot

5、rexate，MTX)組(1×10-6 mol/L)，京尼平苷高(1×10-5mol/L)、中(1×10-6 mol/L)和低(1×10-7 mol/L)三種劑量組，共六組。采用MTT法檢測滑膜細(xì)胞增殖，分別觀察滑膜細(xì)胞在24h、48h和72h后的細(xì)胞增殖率。
　　3、將分別給藥后的RSC-364滑膜細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)72h，用Hoechst33342和AO-PI雙染分別進(jìn)行細(xì)胞染色。在熒光顯微鏡下觀察給予三種不同濃度京尼平苷藥物后凋亡

6、和壞死的RSC-364滑膜細(xì)胞的形態(tài)學(xué)改變。
　　4、用流式細(xì)胞儀測定對照組，模型組，MTX陽性藥物組(1×10-6mol/L)，Ge高(1×10-5 mol/L)、中(1×10-6 mol/L)、低（1×10-7 mol/L）各組中的RSC-364細(xì)胞中的總DNA含量并計算細(xì)胞凋亡率。
　　5、用ELISA法分別測定對照組，模型組，MTX陽性藥物組(1×10-6mol/L)，Ge高(1×10-5 mol/L)、中(1×10

7、-6 mol/L)、低(1×10-7 mol/L)各組中RSC-364滑膜細(xì)胞上清液中的TNF-α、 IL-1β、IL-6、IL-10、MMP-3和MMP-9濃度表達(dá)水平。
　　6、放射免疫法分別測定對照組，模型組，MTX陽性藥物組(1×10-6mol/L)，Ge高(1×10-5 mol/L)、中(1×10-6 mol/L)、低(1×10-7 mol/L)各組中RSC-364滑膜細(xì)胞內(nèi)環(huán)磷酸腺苷(cyclic adenosine

8、monophosphate，cAMP)蛋白水平。
　　7、分別提取對照組，模型組，MTX陽性藥物組(1×10-6 mol/L)，Ge高(1×10-5 mol/L)、中(1×10-6 mol/L)、低(1×10-7 mol/L)各組中RSC-364滑膜細(xì)胞的總RNA并進(jìn)行定量和純度測定，引物設(shè)計，用RT-PCR法測定各組細(xì)胞中的Gs、Gi基因的mRNA表達(dá)。
　　8、分別提取對照組，模型組，MTX陽性藥物組(1×10-6 mo

9、l/L)，Ge高(1×10-5 mol/L)、中(1×10-6 mol/L)、低(1×10-7 mol/L)各組中RSC-364滑膜細(xì)胞的總蛋白并進(jìn)行定量，并用免疫印跡技術(shù)(Western Blot)檢測總JNK1/2、ERK1/2、p38的蛋白表達(dá)以及磷酸化的JNK1/2、ERK1/2、p38的蛋白表達(dá)。
　　結(jié)果:
　　1、經(jīng)PMA誘導(dǎo)48h后的人單核細(xì)胞株THP-1細(xì)胞完全貼壁，細(xì)胞表面有偽足生成。加入巨噬細(xì)胞上清液刺

10、激后的RSC-364滑膜細(xì)胞的生長速度較對照組(Control)明顯加快。
　　2、Ge連續(xù)作用72h，與對照組(Control)相比，模型組(Model) RSC-364滑膜細(xì)胞增殖率明顯增加(P＜0.01)。與模型組(Model)相比，24h和48h時MTX陽性藥物組(1×10-6 mol/L)、Ge高劑量(1×10-5 mol/L)、Ge中劑量組(1×10-6 mol/L)和Ge低劑量組(1×10-7 mol/L)五組中RS

11、C-364滑膜細(xì)胞增殖率顯著降低(P＜0.01或P＜0.05)，72h時MTX陽性藥物組(1×10-6mol/L)、Ge高劑量(1×10-5 mol/L)、Ge中劑量組(1×10-6 mol/L)三組中RSC-364滑膜細(xì)胞增殖率明顯降低(P＜0.01)。
　　3、經(jīng)AO-PI染色后，對照組（Control）和模型組(Model)中大部分RSC-364滑膜細(xì)胞呈現(xiàn)出均勻的綠色熒光。Ge高劑量組(1×10-5 mol/L)、Ge中劑

12、量組(1×10-6 mol/L)、Ge低劑量組(1×10-7 mol/L)和MTX陽性藥物組（1×10-6 mol/L）四組中出現(xiàn)橘黃色的凋亡細(xì)胞和紅色的死亡細(xì)胞，胞膜皺褶，胞核固縮或破裂，以MTX陽性藥物組(1×10-6 mol/L)和Ge高劑量組(1×10-5 mol/L)中凋亡細(xì)胞最多;經(jīng)Hoechst33342染色后，對照組（Control）和模型組(Model)中大部分滑膜細(xì)胞呈現(xiàn)出均勻的、低強(qiáng)度的淡藍(lán)色熒光。隨著Ge藥物濃度

13、的增加，染色體DNA發(fā)生斷裂并相互聚集，并出現(xiàn)凋亡小體，細(xì)胞呈現(xiàn)出強(qiáng)度較高的亮藍(lán)色熒光，以MTX陽性藥物組(1×10-6 mol/L)和Ge高劑量組(1×10-5 mol/L)最為明顯。
　　4、對照組(Control)和模型組(Model)細(xì)胞凋亡率分別為3.8％和4.3％，而Ge高劑量組(1×10-5 mol/L)為31.3％，Ge中劑量組(1×10-6 mol/L)為26.5％，Ge低劑量組(1×10-7 mol/L)為9.

14、3％，MTX陽性藥物組(1×10-6mol/L)為35.6％，可見，與對照組(Control)和模型組(Model)相比，Ge高（1×10-5 mol/L）、中(1×10-6 mol/L)、低(1×10-7mol/L)三個劑量組和MTX陽性藥物組(1×10-6 mol/L)均可使RSC-364滑膜細(xì)胞凋亡率上升。
　　5、與對照組(Control)相比，模型組(Model)中的IL-1β，TNF-α、IL-6、MMP-3和MMP-

15、9濃度水平均有明顯升高(P＜0.01)。與模型組(Model)比較，MTX陽性藥物組(1×10-6 mol/L)和Ge三個劑量組中的IL-1β，TNF-α、IL-6、MMP-3和MMP-9濃度水平有不同程度的降低(P＜0.01或P＜0.05)。與對照組(Control)相比，模型組(Model)中的IL-10濃度水平明顯下降(P＜0.01)。與模型組(Model)比較，IL-10表達(dá)水平隨Ge濃度的增加呈劑量依賴性升高，以Ge高劑量組(

16、1×10-5 mol/L)最為明顯。
　　6、與對照組(Control)相比，模型組(Model)中cAMP水平有明顯下降(P＜0.01)。與模型組(Model)比較，cAMP濃度水平隨Ge濃度增加呈劑量依賴性升高(P＜0.01或P＜0.05)，以Ge高劑量組(1×10-5 mol/L)最為明顯(P＜0.01)。與模型組(Model)相比，MTX陽性藥物組(1×10-6mol/L) cAMP水平明顯升高(P＜0.01)。
　

17、　7、與對照組(Control)相比，模型組(Model)中Gi mRNA基因表達(dá)明顯上升(P＜0.01)。與模型組(Model)比較，Ge高(1×10-5 mol/L)、中(1×10-6 mol/L)劑量組及MTX陽性藥物組(1×10-6 mol/L)均對滑膜細(xì)胞Gi mRNA基因表達(dá)有顯著抑制作用(P＜0.01)。與對照組（Control）相比，模型組(Model)中Gs mRNA基因表達(dá)明顯降低(P＜0.01)。與模型組(Mode

18、l)比較，Ge高(1×10-5 mol/L)、中(1×10-6 mol/L)劑量組及MTX陽性藥物組(1×10-6 mol/L)均可上調(diào)滑膜細(xì)胞Gs mRNA基因表達(dá)水平（P＜0.01或P＜0.05），而Ge低劑量組(1×10-7 mol/L)效果不明顯(P＞0.05)。
　　8、與對照組(Control)相比，模型組(Model)中p-p38、p-JNK1/2、p-ERK1/2的蛋白表達(dá)明顯增強(qiáng)(P＜0.01)。與模型組(Mod

19、el)相比，Ge高(1×10-5 mol/L)、中(1×10-6 mol/L)、低(1×10-7 mol/L)三劑量組均可有效抑制p-p38、p-JNK1/2、p-ERK1/2的蛋白表達(dá)(P＜0.01或P＜0.05)。與模型組(Model)比較，MTX陽性藥物組(1×10-6 mol/L)可以顯著降低p-p38、p-JNK1/2、p-ERK1/2的蛋白表達(dá)(P＜0.01)。 MTX陽性藥物組(1×10-6 mol/L)和Ge不同濃度組對

20、p38、JNK1/2、ERK1/2的蛋白水平無明顯影響。
　　結(jié)論:
　　1、通過體外誘導(dǎo)單核細(xì)胞THP-1為巨噬細(xì)胞，用LPS刺激其分泌IL-1β，TNF-α等炎癥因子，能夠使RSC-364滑膜細(xì)胞過度增殖。
　　2、京尼平苷能夠有效降低RSC-364細(xì)胞在炎癥環(huán)境下的滑膜細(xì)胞增殖，同時影響相應(yīng)促炎癥因子和相關(guān)蛋白的產(chǎn)生和分泌。
　　3、京尼平苷通過提高Gs基因的mRNA表達(dá)，降低Gi基因的mRNA表達(dá)，使cA