甲基氧化偶氮甲醇誘導(dǎo)皮質(zhì)發(fā)育障礙動(dòng)物模型的研究.pdf

1、大腦皮質(zhì)發(fā)育障礙(malformation of cortical development，MCD)是由諸多基因和環(huán)境因素影響神經(jīng)細(xì)胞增殖、遷移和分化而致腦發(fā)育異常的一類(lèi)疾病，然而患者的臨床表現(xiàn)卻存在差異:有些患者癥狀出現(xiàn)早，表現(xiàn)為嚴(yán)重的神經(jīng)功能缺損，而有些患者則表現(xiàn)為癲癇或需要通過(guò)篩選才能發(fā)現(xiàn)的無(wú)明顯癥狀的神經(jīng)功能缺損。分子生物學(xué)，遺傳學(xué)以及影像學(xué)的快速發(fā)展既豐富了人們對(duì)大腦皮質(zhì)正常發(fā)育及其異常導(dǎo)致的大腦畸形種類(lèi)的認(rèn)識(shí)，同時(shí)也積累了大

2、量臨床以及基礎(chǔ)研究數(shù)據(jù)并基于這些發(fā)現(xiàn)提出了許多假說(shuō)。限于臨床研究以及對(duì)病理標(biāo)本的基礎(chǔ)研究的局限性，合適的動(dòng)物模型是非常必要的補(bǔ)充，其不僅在驗(yàn)證臨床以及基礎(chǔ)研究的結(jié)果等方面發(fā)揮著非常重要的作用，其還為轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)的發(fā)展做出了巨大貢獻(xiàn)。在妊娠期給予甲基氧化偶氮甲醇(Methylazoxymethanol，MAM)處理的孕鼠的后代因具有與MCD患者相似的病理改變，分子生物學(xué)以及行為學(xué)改變而被認(rèn)為是很有前景的MCD模型并備受關(guān)注。
　　糖皮質(zhì)

3、激素受體(Glucocorticoid receptor，GR)和鹽皮質(zhì)激素受體(Mineralocorticoidreceptor，MR)均屬于核受體超家族，其配體均為糖皮質(zhì)激素，對(duì)基因轉(zhuǎn)錄有調(diào)節(jié)作用，從而對(duì)細(xì)胞增殖，分化和凋亡程序進(jìn)行調(diào)控。對(duì)下丘腦-垂體-腎上腺軸(Hypothalamic-pituitary-adrenal axis，HPA)功能的維持有著非常重要的作用，且已證實(shí)多種疾病與其異常有關(guān)。癲癇是神經(jīng)系統(tǒng)常見(jiàn)疾病之一，其

4、發(fā)生與HPA軸關(guān)系密切;MCD是癲癇的重要病因，且往往表現(xiàn)為難治性癲癇，對(duì)糖皮質(zhì)激素治療反應(yīng)差，而激素需與受體結(jié)合才能發(fā)揮作用，因此，受體異常是其可能原因。鑒于GR、MR的重要功能，我們推測(cè)GR、MR可能與MCD形成及其致癇機(jī)制有關(guān)。
　　目的:運(yùn)用MAM誘導(dǎo)新型的MCD大鼠模型;研究其病理改變程度與其年齡的關(guān)系、癲癇發(fā)作易感性及癲癇發(fā)作對(duì)已存在的MCD病理形態(tài)的影響;研究GR和MR在MCD動(dòng)物模型大腦皮質(zhì)中的表達(dá)，探討其在MCD

5、形成及MCD致癇機(jī)制中的作用。
　　方法:對(duì)妊娠15天的SD孕鼠間隔12小時(shí)給予二次腹腔注射MAM建立MCD模型，對(duì)照組給予生理鹽水處理;觀察子鼠的日常行為并在產(chǎn)后第90天時(shí)行頭皮腦電圖檢測(cè)。琉瑾-吉姆薩染色被運(yùn)用于顯示P0、7、14、28、60、90子鼠大腦皮質(zhì)與海馬結(jié)構(gòu)，NeuN免疫熒光染色被運(yùn)用于顯示神經(jīng)元的分布。采用匹魯卡品誘導(dǎo)癲癇發(fā)作建立癲癇模型并研究癲癇發(fā)作對(duì)MCD病理形態(tài)的影響。利用Real Time-PCR(RT-

6、PCR)、Western Blot技術(shù)分別檢測(cè)2月齡MCD模型病變大腦皮質(zhì)與對(duì)照組對(duì)應(yīng)部位大腦皮質(zhì)中GR、MR的mRNA和蛋白水平表達(dá)。
　　結(jié)果:MAM組子鼠反應(yīng)遲鈍，活動(dòng)量減少。MAM組大腦皮質(zhì)尺寸較對(duì)照組明顯減少，其皮層變薄，上、下丘腦不能被枕葉完全覆蓋;對(duì)腦質(zhì)量分析發(fā)現(xiàn)除P0組外，其他組中MAM組腦質(zhì)量明顯輕于對(duì)照組。病理染色及免疫熒光染色顯示MAM組子鼠大腦皮質(zhì)較對(duì)照組變薄，其層狀結(jié)構(gòu)紊亂，皮質(zhì)和海馬內(nèi)出現(xiàn)團(tuán)塊狀的增殖結(jié)

7、節(jié)、異位神經(jīng)元和胞體較大的異形神經(jīng)元，且鼠齡越長(zhǎng)病理改變?cè)矫黠@。MAM組癲癇易感性增高，給予較低劑量匹魯卡品即能出現(xiàn)全身強(qiáng)直發(fā)作，即Ⅳ-Ⅴ級(jí)癲癇樣發(fā)作，甚至癲癇持續(xù)狀態(tài)，繼之偶有自發(fā)癲癇發(fā)作，病理檢查見(jiàn)肥大/異形的錐形神經(jīng)元，其皮質(zhì)發(fā)育異常的程度較單純MAM組加重。RT-PCR結(jié)果顯示MAM組大腦皮質(zhì)中的GR mRNA相對(duì)表達(dá)量較對(duì)照組顯著降低(p＜0.05)，MR mRNA則無(wú)明顯差異;與RT-PCR結(jié)果一致，Western Blot

8、結(jié)果顯示MAM組大腦皮質(zhì)中的GR蛋白表達(dá)較對(duì)照組顯著降低(p＜0.05)，MR蛋白表達(dá)則無(wú)明顯差異。
　　結(jié)論:對(duì)妊娠15夭SD孕鼠給予二次腹腔注射MAM可成功建立MCD模型，其病理特征與MCD患者病理改變極為相似，且病變程度隨著鼠齡增長(zhǎng)而加重，提示MAM模型是研究MCD的適合模型;MAM組癲癇易感性增高，聯(lián)合匹魯卡品誘導(dǎo)癲癇發(fā)作后其病理改變程度較單純MAM組加重，提示基于MAM模型的匹魯卡品“二次打擊”法可能是建立基于MCD的癲