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![基于巨噬細胞極化調控的青藤堿4-羥基棕櫚酸酯抗炎機制研究.pdf_第1頁](https://static.zsdocx.com/FlexPaper/FileRoot/2019-3/10/8/b45b6c95-15dc-4227-98eb-fab61f8eec0d/b45b6c95-15dc-4227-98eb-fab61f8eec0d1.gif)
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文檔簡介
1、青藤堿(sinomenino,SIN)是一種來源于防己科植物毛青藤(Sinomenium actum Rehd.et wils.Var cinerrum Rehd.et wils)及青藤(Sinomenium actum Rehd.et wils.)干燥藤莖的生物堿類成分,其結構與嗎啡相似。臨床上用其鹽酸鹽或者磷酸鹽的制劑治療風濕性疾病及心率失常等。但是,長期使用發(fā)現其存在用量大、起效慢、半衰期短等缺陷。本課題組對其進行結構修飾,合成了
2、一系列青藤堿4-羥基酯化物,前期的工作中發(fā)現青藤堿4-羥基棕櫚酸酯(C16)有很好的抗炎效果。
內毒素血癥是全身性的多器官衰竭的惡性炎癥反應,死亡率極高。在臨床上尤其是創(chuàng)傷外科,一直是難以克服的一大難題。巨噬細胞是一種重要的免疫細胞,在不同的微環(huán)境中或者細胞因子的刺激下,可以極化為M1或M2型。巨噬細胞根據其功能亞型的不同,參與不同信號通路的調節(jié)。
所以,本研究在LPS誘導的小鼠內毒素血癥模型上,對C16進行抗炎活性
3、評價;探究C16基于調節(jié)巨噬細胞極化相關的抗炎機制,具體工作如下:
(1) C16的制備及毒副作用評價
根據前藥設計與拼合原理,以DMAP為催化劑,EDC為縮合劑,青藤堿4位羥基取代反應與棕櫚酸結合,制備青藤堿4-羥基棕櫚酸酯,并對其進行核磁共振氫譜以及質譜的結構鑒定??疾霤16對小鼠的肝腎毒性,檢測血清指標ALT、AST的活性以及BUN的含量;對肝臟、腎臟做組織病理切片觀察。結果表明,與模型組相比,C16作用后,各
4、生化指標顯著降低,小鼠肝、腎組織無明顯損傷。
(2)C16對LPS所致內毒素血癥小鼠的治療作用
將10 mg/mL LPS注射于小鼠腹腔,建立內毒素血癥模型。在此模型上,考察C16高、低劑量作用下的抗炎作用,并與其先導化合物SIN作對照。發(fā)現C16與SIN作用后,感染內毒素血癥的小鼠存活率顯著提高;與模型組相比,外周血清中炎癥因子IL-1β、IL-6和TNF-α的表達顯著降低;心、脾、肺和腎臟組織中炎癥因子IL-1β
5、和IL-6 mRNA表達也相應的降低。C16高劑量組抗炎作用效果強于低劑量組,且與SIN相比,作用效果更明顯。
(3)C16對巨噬細胞的調控作用
在體外巨噬細胞模型上,采用MTT法檢測C16對巨噬細胞增殖的影響;采用流式細胞術分析C16對巨噬細胞凋亡的影響。結果顯示,C16在5?M以下對細胞增殖沒有明顯的抑制作用,對細胞凋亡也無顯著影響。該部分工作為下步實驗優(yōu)選了合適的作用濃度。之后,采用500 ng/mL LPS誘
6、導巨噬細胞向M1型極化;20 ng/mL IL-4誘導巨噬細胞向M2型極化。在傳代巨噬細胞ANA-1以及原代腹腔巨噬細胞模型上,采用多種方法檢測了巨噬細胞 M1型和 M2型相關因子的表達。qRT-PCR技術檢測了細胞中iNOS、Arg-1、CD206、Ym1以及Fizz1 mRNA的表達;試劑盒檢測了iNOS和Arg-1的酶活性;Western Blot分析了細胞中iNOS和Arg-1在蛋白水平的改變;ELISA試劑盒檢測細胞上清液中炎
7、癥因子IL-1β與TNF-α的含量。多種方法綜合分析發(fā)現,C16作用后,與模型組相比,M1型相關因子在不同水平的表達都顯著下降,M2型相關因子在不同水平的表達都顯著上升。結果表明,C16能很好的抑制巨噬細胞向M1型極化,促進巨噬細胞向M2型極化。
(4)C16調節(jié)巨噬細胞極化的分子機制
該部分采用Western Blot技術,檢測了MAPK、JAK/STAT、PI3K/AKT通路的相關信號的表達。分別檢測了p38、S
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