京尼平交聯(lián)兔脫細胞氣管支架原位移植的實驗研究.pdf

1、先天性畸形、創(chuàng)傷、腫瘤、感染、損傷后長期氣管插管和某些自身免疫性疾病，可以導致氣管狹窄或壞死，需要氣管重建或移植。各種良性或惡性氣管病變患者的主要治療方法為氣管切除術。然而，當病變的氣管長度達到兒童的30％或成人的50％時，切除病變氣管直接端端吻合將帶來巨大風險。組織工程是結合工程技術和生物學原理應用于功能性組織替代的一個新興研究，以促進受損組織再生，有望成為長段氣管重建的有效治療手段。
　　本研究以新西蘭兔為對象，通過脫細胞及京

2、尼平交聯(lián)方法得到氣管支架，并種植自體骨髓間充質干細胞，運用生長因子，原位移植氣管，綜合評估原位移植效果，監(jiān)測其免疫原性和排斥反應。在此基礎上，通過梯度離心法獲取自體骨髓單個核細胞，并使用細胞示蹤劑綠色熒光蛋白標記自體骨髓單個核細胞。含有綠色熒光蛋白標記的自體骨髓單個核細胞可以在脫細胞氣管支架上分化為軟骨細胞，這一實驗過程避免了干細胞在體外培養(yǎng)，大大縮短了組織工程氣管的制備周期，節(jié)約了時間和經(jīng)濟成本，為需要組織工程氣管移植的患者爭取了更多

3、的治療時間。
　　第一部分京尼平交聯(lián)脫細胞氣管支架種植自體骨髓間充質干細胞的體內(nèi)原位移植研究
　　目的:
　　通過對由京尼平交聯(lián)的脫細胞氣管支架進行原位移植，并在術中種植自體骨髓間充質干細胞進行研究，觀察骨髓間充質干細胞在體內(nèi)分化為軟骨細胞的情況，并對上皮細胞再生情況及移植后炎癥排斥反應進行評價。
　　方法:
　　1.脫細胞氣管支架的制備;
　　2.脫細胞氣管支架的體外檢測;
　　3.自體骨髓間

4、充質干細胞的培養(yǎng)與鑒定;
　　4.氣管原位移植;
　　5.氣管原位移植后檢測。
　　結果:
　　1.氣管脫細胞后，上皮細胞清除完全，軟骨細胞大部分被清除，Ⅱ型膠原保留完整;
　　2.通過全骨髓培養(yǎng)貼壁篩選法獲取骨髓間充質干細胞，培養(yǎng)至第3代的骨髓間充質干細胞形態(tài)規(guī)則，具有多項分化潛能;
　　3.脫細胞后京尼平交聯(lián)的氣管支架加骨髓間充質干細胞原位移植后，炎癥反應程度與自體原位移植相似，種植的骨髓間充質干

5、細胞在體內(nèi)可以分化為軟骨細胞。
　　結論:
　　1.通過去污劑-聯(lián)合酶法獲取了脫細胞氣管支架，運用天然交聯(lián)劑京尼平交聯(lián)得到了京尼平交聯(lián)脫細胞氣管支架;
　　2.采用全骨髓貼壁培養(yǎng)法分離純化了自體骨髓間充質干細胞，利用骨髓間充質干細胞的形態(tài)特征及多向分化潛能鑒定了自體骨髓間充質干細胞;
　　3.種植有自體骨髓間充質干細胞的脫細胞氣管支架在原位移植實驗中取得成功，自體骨髓間充質干細胞在體內(nèi)分化為軟骨細胞，未發(fā)生明顯的

6、排斥反應。
　　第二部分京尼平交聯(lián)脫細胞氣管支架種植自體骨髓單個核細胞的體內(nèi)原位移植研究
　　目的:
　　通過對含有綠色熒光蛋白示蹤劑的骨髓單個核細胞在京尼平交聯(lián)的脫細胞氣管支架原位移植中的研究，觀察骨髓單個核細胞內(nèi)綠色熒光蛋白含量，評估種植的自體骨髓單個核細胞分化為軟骨細胞的情況，并對使用生長因子后外周血中單個核細胞含量進行評價，探討自體骨髓單個核細胞在組織工程氣管移植中的作用。
　　方法:
　　1.脫細

7、胞氣管支架的制備;
　　2.293T細胞的復蘇及培養(yǎng);
　　3.轉染質粒的獲取;
　　4.293T細胞的轉染;
　　5.自體骨髓單個核細胞的獲取;
　　6.慢病毒的獲取及細胞的感染;
　　7.氣管原位移植;
　　8.氣管移植后單個核細胞含量檢測及單個核細胞分化為軟骨細胞情況的檢測。
　　結果:
　　1.293T轉染含有綠色熒光蛋白質粒后細胞表達綠色熒光蛋白，并能合成含有綠色熒光蛋白可

8、以感染其他細胞的慢病毒;
　　2.含有綠色熒光蛋白的慢病毒可以感染骨髓單個核細胞，在熒光顯微鏡下可以看到細胞內(nèi)有綠色熒光出現(xiàn);
　　4.種植有含綠色熒光蛋白的自體骨髓單個核細胞的京尼平交聯(lián)脫細胞氣管支架原位移植后，種植的骨髓單個核在體內(nèi)可以分化為軟骨細胞，在分化成的軟骨細胞中含有綠色熒光蛋白。
　　結論:
　　1.綠色熒光蛋白可以在293T細胞內(nèi)被包裝在慢病毒內(nèi)，在不影響其他細胞活性的情況下將綠色熒光蛋白轉入其他

9、細胞中;
　　2.通過梯度離心得到的自體骨髓單個核細胞可以被含有綠色熒光蛋白的慢病毒感染，綠色熒光蛋白在不影響骨髓單個核細胞的情況下對其進行標記;
　　3.通過慢病毒感染的方法對自體骨髓單個核細胞進行示蹤，鑒定氣管移植后再生的軟骨細胞由種植的自體骨髓單個核細胞分化而來;
　　4.自體骨髓單個核細胞在原位移植的京尼平交聯(lián)脫細胞氣管支架上可以分化為軟骨細胞，這一過程避免了干細胞體外培養(yǎng)過程，節(jié)省了時間成本和經(jīng)濟成本。與骨髓