受體上皮細(xì)胞灌注后大鼠氣管異位移植再上皮化的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、現(xiàn)有的技術(shù)條件下，氣管環(huán)形切除的長(zhǎng)度一般不宜超過(guò)成人氣管的1/2(約6cm)、嬰幼兒氣管的1/3，否則將無(wú)法實(shí)施端端吻合。而更長(zhǎng)段氣管的切除后重建則需通過(guò)同種異體氣管移植、人工或組織工程氣管植入或自體組織再造來(lái)完成。相比較而言，同種異體氣管移植具有相當(dāng)?shù)膬?yōu)勢(shì)，因此始終是氣管外科領(lǐng)域中的熱點(diǎn)。但是，同種異體氣管移植目前仍主要處于實(shí)驗(yàn)研究階段，成功的臨床病例報(bào)道非常少，均為單一病例報(bào)道，而且往往缺乏長(zhǎng)期的隨訪結(jié)果。這其中主要的困難之一就是免

2、疫排斥。而免疫抑制治療雖然能夠提高移植成功率，但同時(shí)也大大增加了感染和罹患腫瘤的可能性，因此不少學(xué)者都在尋找新途徑來(lái)抑制移植免疫排斥反應(yīng)，而其中方法之一便是直接降低供體氣管的抗原性。
　　 研究發(fā)現(xiàn)，去除供體氣管的上皮細(xì)胞能夠消除或者減弱氣管組織的抗原性，從而抑制移植免疫排斥反應(yīng)，而無(wú)需或僅需低劑量的免疫抑制治療。但是，氣管上皮細(xì)胞不但對(duì)于恢復(fù)氣管正常功能具有重要意義，而且在移植過(guò)程中也發(fā)揮著關(guān)鍵作用。因此，理想的解決方法是：以

3、受體上皮細(xì)胞取代供體氣管原有的上皮細(xì)胞。也就是說(shuō)，在去除供體氣管的上皮細(xì)胞之后，采取措施促進(jìn)受體源性的再上皮化。從而既達(dá)到了降低氣管組織抗原性的目的，又避免了上皮細(xì)胞丟失所造成的不良后果。
　　 迄今為止，國(guó)外對(duì)于氣管移植過(guò)程中供體裸氣管內(nèi)實(shí)現(xiàn)受體源性再上皮化的相關(guān)研究極少，而國(guó)內(nèi)更是未見(jiàn)有類似的研究。因此，其中很多關(guān)鍵環(huán)節(jié)尚未得到清晰闡釋，理論基礎(chǔ)相當(dāng)薄弱，技術(shù)方法也并不完備。本研究計(jì)劃在胰酶冷消化法去除供體氣管上皮細(xì)胞的同時(shí)

4、，將受體氣管上皮細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)，制備成細(xì)胞懸液后灌注于供體裸氣管內(nèi)，再異位移植于免疫功能正常的受體大鼠皮下，完成受體源性的再上皮化；從而對(duì)這一方法的實(shí)際效果進(jìn)行客觀的評(píng)價(jià)，并進(jìn)一步優(yōu)化現(xiàn)有的技術(shù)手段，同時(shí)詳細(xì)勾勒出具體的演進(jìn)過(guò)程，完善氣管移植再上皮化的理論體系，為今后的大動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)酥僚R床研究奠定基礎(chǔ)。
　　 第一部分、大鼠氣管上皮細(xì)胞培養(yǎng)和灌注、供體裸氣管制備和氣管異位移植模型建立
　　 目的:
　　 本研究設(shè)

5、想在消除供體氣管上皮組織之后，將受體氣管上皮細(xì)胞種植在供體裸氣管內(nèi)再進(jìn)行移植，從而在降低供體氣管免疫原性的同時(shí)完成受體源性的再上皮化，達(dá)到氣管成功移植的目的。而其中的關(guān)鍵點(diǎn)在于供體裸氣管的制備、氣管上皮細(xì)胞的體外培養(yǎng)和氣管內(nèi)灌注、相關(guān)動(dòng)物模型的建立。
　　 方法:
　　 上皮細(xì)胞培養(yǎng)及細(xì)胞懸液制備：采用無(wú)血清完全F12培養(yǎng)基對(duì)SD大鼠氣管上皮細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)，并調(diào)整細(xì)胞濃度，使其達(dá)到10×106/ml。
　　 供

6、體大鼠裸氣管制備：以Wistar大鼠(n=80)作為供體，取長(zhǎng)約1.5-2.0cm的氣管，一端結(jié)扎后灌入0.25％的胰酶溶液至氣管微漲，再用絲線將另一端結(jié)扎，放入4℃冰箱18小時(shí)后取出，進(jìn)行組織學(xué)切片HE染色檢測(cè)上皮細(xì)胞消化結(jié)果，合格的裸氣管以細(xì)胞培養(yǎng)液保存?zhèn)溆谩?br>　　 上皮細(xì)胞灌注及大鼠氣管異位移植模型建立：結(jié)扎供體裸氣管一端，灌入己制備好的細(xì)胞懸液，再結(jié)扎另一端。以SD大鼠(n=80)作為受體，在背部皮膚剪一小口后，于皮下游

7、離一隧道，隧道頂端位于項(xiàng)部。將灌有上皮細(xì)胞懸液的供體氣管置入隧道頂端皮下，縫合皮膚切口后進(jìn)行飼養(yǎng)。
　　 結(jié)果:
　　 上皮細(xì)胞培養(yǎng)及細(xì)胞懸液制備：氣管上皮細(xì)胞為圓形，折光度好，懸浮在培養(yǎng)液中。24小時(shí)后可見(jiàn)細(xì)胞大部分開(kāi)始貼壁；3天后見(jiàn)細(xì)胞貼壁呈現(xiàn)鋪路石樣；4-5天后細(xì)胞增殖成片狀的細(xì)胞團(tuán)。
　　 供體裸氣管制備：HE染色提示，供體氣管上皮細(xì)胞完全被去除，基底膜完整，軟骨組織正常。
　　 上皮細(xì)胞灌注及大

8、鼠氣管異位移植模型建立：每例模型建立平均用時(shí)5.2±1.5分鐘。全組(n=80)受體動(dòng)物術(shù)后無(wú)一例死亡，生存率為100％，亦未出現(xiàn)感染等術(shù)后并發(fā)癥。
　　 結(jié)論:
　　 采用胰酶冷消化法能夠安全、徹底去除氣管上皮細(xì)胞，而對(duì)其它組織基本無(wú)損傷；改進(jìn)型無(wú)血清完全型F12培養(yǎng)方法體外培養(yǎng)上皮細(xì)胞培養(yǎng)效果良好，是一種相對(duì)簡(jiǎn)單、實(shí)用、有效的培養(yǎng)方法；細(xì)胞懸液灌注進(jìn)行上皮細(xì)胞在氣管內(nèi)的種植，操作十分簡(jiǎn)便，能夠很好的保留細(xì)胞懸液，為上

9、皮細(xì)胞的貼壁、生長(zhǎng)和分化創(chuàng)造了條件；大鼠背部皮下氣管異位移植模型操作簡(jiǎn)單、存活率高。
　　 第二部分、免疫抑制治療對(duì)受體上皮細(xì)胞灌注后大鼠氣管異位移植再上皮化的影響
　　 目的:
　　 上皮細(xì)胞被完全去除之后，氣管其它組織依然存活，其中某些細(xì)胞和組織也存在有MHC抗原。這也就意味著供體裸氣管仍然具有一定的免疫原性，移植后仍然有可能誘發(fā)一定程度的免疫排斥反應(yīng)。而免疫排斥反應(yīng)是否會(huì)對(duì)受體源性的再上皮化過(guò)程產(chǎn)生不利影響

10、?是否需要實(shí)施免疫抑制治療?免疫抑制治療的最佳方案是什么?在適當(dāng)條件下受體上皮細(xì)胞灌注后大鼠氣管異位移植的最終結(jié)果如何?這些問(wèn)題都需要通過(guò)進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)來(lái)給予解答。
　　 方法:
　　 大鼠氣管異位移植模型建立后，將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物完全隨機(jī)分為六組。對(duì)照組1(n=10)：供體裸氣管內(nèi)灌入生理鹽水，不使用任何免疫抑制劑；對(duì)照組2(n=10)：供體裸氣管內(nèi)灌注受體上皮細(xì)胞懸液，不使用任何免疫抑制劑；實(shí)驗(yàn)組1(n=10)：供體裸氣管內(nèi)灌

11、注受體上皮細(xì)胞懸液，移植后受體鼠每日肌肉注射FK506(0.5 mg/kg/d)，連續(xù)使用3天；實(shí)驗(yàn)組2(n=10)：供體裸氣管內(nèi)灌注受體上皮細(xì)胞懸液，移植后受體鼠每日肌肉注射FK506(0.5 mg/kg/d)，連續(xù)使用10天；實(shí)驗(yàn)組3(n=10)：供體裸氣管內(nèi)灌注受體上皮細(xì)胞懸液，移植后受體鼠每日肌肉注射FK506(1.0 mg/kg/d)，連續(xù)使用3天；實(shí)驗(yàn)組4(n=10)：供體裸氣管內(nèi)灌注受體上皮細(xì)胞懸液，移植后受體鼠每日肌肉注

12、射FK506(1.0 mg/kg/d)，連續(xù)使用10天。移植后第28天，處死大鼠，取出移植氣管，標(biāo)本分切后分別進(jìn)行以下檢測(cè)：組織形態(tài)學(xué)評(píng)價(jià)、透射電鏡觀察、淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)計(jì)數(shù)、上皮細(xì)胞分化鑒定(CK14、CK18和CFTR)、上皮細(xì)胞纖毛比例和氣管壁纖維組織含量測(cè)定。
　　 結(jié)果：
　　 實(shí)驗(yàn)組的總體情況明顯優(yōu)于對(duì)照組。其中，對(duì)照組1的結(jié)果最不理想，未見(jiàn)任何上皮細(xì)胞再生，而且管腔出現(xiàn)嚴(yán)重狹窄、閉塞；對(duì)照組2也并未實(shí)現(xiàn)再上皮化

13、，但稍好于對(duì)照組1；實(shí)驗(yàn)組1和實(shí)驗(yàn)組2相比，各項(xiàng)檢測(cè)結(jié)果基本相似：氣管內(nèi)壁僅在局部有上皮細(xì)胞再生，且細(xì)胞尚未分化成熟，從而提示在這兩組中存在有受體源性的再上皮化，但結(jié)果并不理想；實(shí)驗(yàn)組3和實(shí)驗(yàn)組4的結(jié)果非常相近，同時(shí)也是最為理想的：受體源性再上皮化取得成功，氣管內(nèi)覆蓋了完整連續(xù)的成熟的纖毛柱狀上皮細(xì)胞，并具有腺體分泌功能、屏障防御功能。
　　 結(jié)論：
　　 供體裸氣管內(nèi)灌注受體上皮細(xì)胞后再實(shí)施異位移植，在一定的條件下，能

14、夠成功實(shí)現(xiàn)受體源性的完全再上皮化；而在這一過(guò)程中，仍需進(jìn)行短期、低劑量的免疫抑制治療；使用FK506的最佳方案是在移植后連續(xù)使用3天，劑量為1.0mg/kg/d；上皮細(xì)胞，即便是尚未附壁的上皮細(xì)胞，可能對(duì)于移植后的阻塞性病變有抑制作用。
　　 第三部分、受體上皮細(xì)胞灌注后大鼠氣管異位移植再上皮化過(guò)程的研究
　　 目的:
　　 第二部分的實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證實(shí)，在短期、低劑量的應(yīng)用免疫抑制劑的情況下，供體裸氣管內(nèi)灌注受體上皮

15、細(xì)胞后再實(shí)施異位移植，能夠成功實(shí)現(xiàn)受體源性的完全再上皮化。但是對(duì)于其具體的演進(jìn)過(guò)程尚缺乏足夠的了解。
　　 方法：
　　 大鼠氣管異位移植模型建立后，將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物完全隨機(jī)分為六組，移植后所有受體鼠每日肌肉注射FK506(1.0 mg/kg/d)，連續(xù)使用3天。在移植后第3天、第7天、第14天、第21天、第28天、第35天，分別隨機(jī)處死一組大鼠(n=10)，取出移植氣管，分切后進(jìn)行以下檢測(cè)：組織形態(tài)學(xué)評(píng)價(jià)、透射電鏡觀察、上皮

16、細(xì)胞分化鑒定(CK14、CK18和CFTR)、上皮細(xì)胞增殖能力檢測(cè)(Ki67)和上皮細(xì)胞纖毛比例測(cè)定。
　　 結(jié)果:
　　 在移植后的第3天，氣管內(nèi)壁局部覆蓋有無(wú)纖毛的扁平上皮細(xì)胞；透射電鏡發(fā)現(xiàn)此處細(xì)胞結(jié)構(gòu)正常，偶見(jiàn)有異常短小、稀疏的類纖毛樣結(jié)構(gòu)，細(xì)胞間隙寬大，未見(jiàn)明顯的細(xì)胞連接；CK14、CK18和CFTR的表達(dá)均處于低水平，Ki67處于高水平，纖毛比例低。
　　 第7天，氣管內(nèi)壁完整覆蓋有無(wú)纖毛的扁平上皮細(xì)胞

17、。其余結(jié)果與第3天相似。
　　 第14天，上皮細(xì)胞層為扁平細(xì)胞和柱狀細(xì)胞交替，透射電鏡發(fā)現(xiàn)部分柱狀細(xì)胞處呈現(xiàn)假?gòu)?fù)層結(jié)構(gòu)，存在杯狀細(xì)胞，柱狀細(xì)胞表面可見(jiàn)少量纖毛，細(xì)胞間隙較窄，可見(jiàn)細(xì)胞連接；CK14和CFTR的表達(dá)仍處于低水平，CK18開(kāi)始升高，Ki67開(kāi)始下降，纖毛比例開(kāi)始升高。
　　 第21天，氣管內(nèi)壁覆蓋完整的柱狀上皮細(xì)胞，偶見(jiàn)刷狀緣，透射電鏡發(fā)現(xiàn)大部分細(xì)胞層為假?gòu)?fù)層結(jié)構(gòu)，其余表現(xiàn)與第14天相似；CK14的表達(dá)仍處于

18、低水平，CK18達(dá)到峰值，CFTR開(kāi)始升高，Ki67繼續(xù)下降，纖毛比例繼續(xù)升高。
　　 第28天，氣管內(nèi)壁覆蓋完整的柱狀上皮細(xì)胞，可見(jiàn)較明顯的刷狀緣，透射電鏡發(fā)現(xiàn)假?gòu)?fù)層結(jié)構(gòu)明顯，可見(jiàn)杯狀細(xì)胞、腺體分泌細(xì)胞、基底細(xì)胞等多種細(xì)胞類型，細(xì)胞間隙狹窄，細(xì)胞連接緊密；CK14和Ki67的表達(dá)處于低水平，CK18維持高水平，CFTR達(dá)到峰值，纖毛比例達(dá)到峰值。
　　 第35天的表現(xiàn)與第28天相仿。
　　 結(jié)論: