腦慢性低灌注對(duì)白質(zhì)功能影響及相關(guān)分子機(jī)制研究.pdf

1、腦慢性低灌注(chronic cerebral hypoperfusion，CCH)可以導(dǎo)致腦缺血缺氧，與血管性癡呆及老年相關(guān)疾病如阿爾茲海默氏病等多種疾病相關(guān)。既往認(rèn)為白質(zhì)對(duì)缺血具有很高的耐受性，但越來越多的研究表明，腦白質(zhì)對(duì)慢性缺血缺氧的敏感性遠(yuǎn)高于皮質(zhì)，特別是富含髓鞘的白質(zhì)，易引起脫髓鞘，導(dǎo)致軸突的不可逆損害。這可能是認(rèn)知障礙等腦功能減退的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。
　　研究發(fā)現(xiàn)神經(jīng)功能的缺失與供應(yīng)腦實(shí)質(zhì)的深穿支小動(dòng)脈以及頸部大動(dòng)脈及其

2、顱內(nèi)分支動(dòng)脈有密切聯(lián)系，當(dāng)動(dòng)脈發(fā)生病變或者狹窄時(shí)會(huì)導(dǎo)致大腦半球深部白質(zhì)部分血流量下降，持續(xù)性的灌流不足可造成白質(zhì)疏松，從而引起神經(jīng)功能的缺失，產(chǎn)生具有臨床意義的神經(jīng)癥狀。腦慢性低灌注導(dǎo)致白質(zhì)損傷的分子機(jī)制缺乏清楚認(rèn)識(shí)。
　　郎飛結(jié)(Ranvier node)的近結(jié)側(cè)區(qū)(juxtaparanode region)粘附分子變化對(duì)髓鞘及軸突功能可產(chǎn)生明顯作用;在膠質(zhì)與軸突相互作用中，細(xì)胞粘附分子起著重要的聯(lián)系作用，而膠質(zhì)/軸突界面變化可

3、引起軸突變性。Caspr2(Contactin-associated protein-2)在軸突與膠質(zhì)細(xì)胞間發(fā)生粘附作用，參與構(gòu)成有髓神經(jīng)纖維近結(jié)側(cè)區(qū)，其病變可抑制軸突與膠質(zhì)細(xì)胞的相互作用，繼而減慢神經(jīng)傳導(dǎo)速度和改變髓鞘結(jié)構(gòu)，在介導(dǎo)正常髓鞘板層形成及神經(jīng)沖動(dòng)的跨節(jié)跳躍傳導(dǎo)起關(guān)鍵作用。Caspr2結(jié)構(gòu)變化還可引起結(jié)區(qū)Na+通道、近結(jié)側(cè)區(qū)K+通道的界限消失，導(dǎo)致白質(zhì)功能變化。Caspr2在腦慢性低灌注狀態(tài)下白質(zhì)損害的作用沒有得到研究和認(rèn)識(shí)。

4、所以，本研究在慢性低灌注下，首先觀察白質(zhì)功能改變，包括傳導(dǎo)功能、突出運(yùn)輸功能和細(xì)胞骨架變化，再進(jìn)一步探討Caspr在白質(zhì)改變中的作用及對(duì)離子通道的影響，探討腦慢性低灌注下白質(zhì)改變的分子機(jī)制。
　　本研究對(duì)SD大鼠進(jìn)行雙側(cè)頸總動(dòng)脈部分狹窄手術(shù)建立腦慢性低灌注模型，通過HE染色、電鏡觀察各組大鼠腦組織的形態(tài)學(xué)變化，證明符合缺血性改變;利用運(yùn)動(dòng)誘發(fā)電位方法檢測各組大鼠（對(duì)照組及術(shù)后2周、4周、12周）的軸突傳導(dǎo)功能;采用免疫組織化學(xué)方法

5、檢測慢性缺血大鼠海馬CA1區(qū)蛋白NF200和Aβ1-40的變化情況;運(yùn)用免疫熒光、激光共聚焦顯微鏡及western blot方法觀察各組大鼠胼胝體區(qū)Caspr2和Na+通道變化情況。對(duì)腦慢性低灌注下白質(zhì)改變的分子機(jī)制進(jìn)行了初步研究和探討，其結(jié)果可能對(duì)臨床慢性腦缺血導(dǎo)致的腦損傷、認(rèn)知減退等多種疾病的防治具有重要指導(dǎo)作用。
　　本研究共分三部分:
　　一、腦慢性低灌注動(dòng)物模型的構(gòu)建及對(duì)腦組織形態(tài)學(xué)的評(píng)價(jià)
　　1.方法

6、>　　在無菌技術(shù)條件下，利用針線法對(duì)SD大鼠的行頸正中切口，分離出雙側(cè)頸總動(dòng)脈。放置注射針頭(直徑約為1.2mm)于距頸內(nèi)外動(dòng)脈交接1.5cm處，用絲線固定頸總動(dòng)脈與針頭，使大鼠雙側(cè)頸總動(dòng)脈部分狹窄，使其出現(xiàn)血流灌注減少，最終形成慢性低灌注，程度可控;維持低灌注狀態(tài)后2周、4周以及12周，通過HE染色，光鏡觀察各組大鼠腦組織的形態(tài)學(xué)變化，證明符合缺血性改變;
　　2.結(jié)果
　　(1)慢性腦灌注不足大鼠模型，除麻醉意外，無死亡

7、，穩(wěn)定性和可重復(fù)性良好，低灌注程度效果穩(wěn)定、可靠;
　　(2)大鼠雙側(cè)頸總動(dòng)脈部分結(jié)扎后，大腦海馬區(qū)錐體細(xì)胞經(jīng)歷了從最初的缺血、水腫，逐漸發(fā)展形成核染色淺淡、嚴(yán)重的神經(jīng)元脫失和微空泡。這種變化符合慢性持續(xù)性腦血流量下降的病理表現(xiàn)，適合腦慢性低灌注實(shí)驗(yàn)研究。
　　二、腦慢性低灌注狀態(tài)下觀察白質(zhì)功能改變，包括傳導(dǎo)功能、運(yùn)輸功能和細(xì)胞骨架變化
　　1.方法
　　采用運(yùn)動(dòng)誘發(fā)電位檢測各實(shí)驗(yàn)組大鼠的運(yùn)動(dòng)誘發(fā)電位潛伏期變化，

8、觀察白質(zhì)傳導(dǎo)功能改變;采用免疫組織化學(xué)方法檢測大鼠海馬CA1區(qū)Aβ1-40和NF200蛋白表達(dá)和分布的變化，了解傳輸功能改變。
　　2.結(jié)果
　　(1)白質(zhì)傳導(dǎo)功能改變:在腦慢性低灌注狀態(tài)下2周、4周以及12周MEP潛伏期顯著延長，并隨低灌注狀態(tài)的維持，MEP潛伏期延長更為明顯，表明腦慢性低灌注導(dǎo)致的腦缺血時(shí)軸索傳導(dǎo)功能受損，隨著低灌注時(shí)間推移其傳導(dǎo)功能加重惡化。
　　(2)傳輸功能改變:實(shí)驗(yàn)觀察到對(duì)照組大鼠腦內(nèi)海馬C

9、A1區(qū)很少有Aβ1-40表達(dá)，但NF200表達(dá)很明顯。腦缺血2周，海馬CA1區(qū)出現(xiàn)Aβ1-40免疫染色陽性細(xì)胞，染色較淺，NF200表達(dá)比對(duì)照組減弱。腦缺血4周，海馬CA1區(qū)出現(xiàn)較多的Aβ1-40免疫染色陽性細(xì)胞;NF200表達(dá)比腦缺血2周組時(shí)還要減弱。腦缺血12周，海馬CA1區(qū)Aβ1-40免疫染色陽性細(xì)胞進(jìn)一步增多;NF200表達(dá)仍在減少。結(jié)果顯示慢性腦灌注不足時(shí)軸突傳輸功能受損，Aβ1-40不能通過軸突輸送至遠(yuǎn)端而在胞體聚集，作為細(xì)

10、胞骨架蛋白NF200表達(dá)降低會(huì)導(dǎo)致軸突損害和傳輸功能改變、軸突變性。
　　三、腦慢性低灌注狀態(tài)下觀察Caspr2、Na+通道蛋白表達(dá)變化
　　1.方法
　　采用免疫熒光、激光共聚焦顯微鏡技術(shù)觀察粘附分子Caspr2的變化、western blot方法檢測Na+通道蛋白表達(dá)。
　　2.結(jié)果
　　采用免疫熒光、激光共聚焦顯微鏡技術(shù)觀察Caspr2在腦慢性低灌注后表達(dá)減少，陽性細(xì)胞數(shù)及染色強(qiáng)度均顯著下降，隨著低灌

11、注持續(xù)時(shí)間越長呈現(xiàn)逐漸下降趨勢，同時(shí)Caspr2的分布模式也發(fā)生明顯改變，縱行條點(diǎn)狀纖維走行出現(xiàn)紊亂，在12周時(shí)局部區(qū)域出現(xiàn)Caspr2陽性顆粒聚集成團(tuán)現(xiàn)象。利用western blot方法檢測到Na+通道蛋白也有同樣進(jìn)行性下降趨勢。提示粘附分子Caspr2在腦慢性低灌注時(shí)存在表達(dá)變化，Na+通道蛋白表達(dá)也降低，Na+通道蛋白表達(dá)降低引起Na+內(nèi)流減弱，影響傳導(dǎo)功能。Caspr2這種變化可能是髓鞘分離及髓鞘脫失、Na+通道蛋白表達(dá)降低及

12、傳導(dǎo)功能減退的重要原因。
　　本研究主要結(jié)論如下:
　　采用雙側(cè)頸總動(dòng)脈部分狹窄的方法建立腦慢性低灌注模型，是研究腦白質(zhì)缺血性損傷病理機(jī)制和治療的較為理想的動(dòng)物模型之一。腦慢性低灌注影響軸突傳導(dǎo)、傳輸功能。運(yùn)動(dòng)誘發(fā)電位出現(xiàn)隨著缺血時(shí)間延長而逐漸延長的趨勢;Aβ1-40在胞體聚集，不能傳輸至軸突遠(yuǎn)端;NF200表達(dá)下降影響軸突結(jié)構(gòu)和傳輸功能。白質(zhì)功能改變可能與Caspr2表達(dá)降低及分布異常、Na+通道蛋白表達(dá)下降有關(guān)。粘附分子