丁苯酞注射液對慢性腦低灌注大鼠腦自由基代謝及PARP蛋白表達(dá)的影響.pdf

1、目的：慢性腦低灌注是血管性癡呆（vascular dementia，VD）、阿爾茨海默?。ˋlzheimer's Disease，AD）和Binswanger病等多種疾病發(fā)展過程中的一個共同病理過程。是指由高血壓、腦動脈硬化引起的腦動脈狹窄所致的腦組織灌注長期低于生理閾值而出現(xiàn)的神經(jīng)系統(tǒng)損害的一種病理狀態(tài)。慢性腦低灌注作為神經(jīng)系統(tǒng)的一種常見病理狀態(tài)，存在于腦動脈硬化、血管性癡呆、AD、Binswanger病及動靜脈畸形等多種疾病的病理過

2、程中，發(fā)病早期以認(rèn)知功能損害為主要表現(xiàn)，最終可導(dǎo)致持久或進(jìn)展性的認(rèn)知與神經(jīng)功能障礙。在我國，VD是老年期癡呆的主要組成部分。VD不僅嚴(yán)重?fù)p害患者的健康及生存質(zhì)量，也給社會和家庭帶來沉重的負(fù)擔(dān)。目前，VD的發(fā)病機(jī)制尚不十分清楚，也無特殊有效的治療方法，因此探討VD的發(fā)病機(jī)理，制定合理的治療方案，是醫(yī)學(xué)領(lǐng)域研究的重要課題。
　　 目前認(rèn)為慢性腦低灌注是VD的主要原因。有研究表明，在低灌注狀態(tài)及低代謝狀態(tài)下認(rèn)知功能可發(fā)生減退，而腦部氧

3、化活性的改變可能是低灌注時產(chǎn)生腦實(shí)質(zhì)和腦微血管系統(tǒng)損害的重要機(jī)制。大量研究表明，氧化損傷在腦缺血后神經(jīng)元損傷中起到了關(guān)鍵作用。自由基增多，其清除劑超氧化物岐化酶（SOD）下降，脂質(zhì)過氧化物增多，其毒性代謝產(chǎn)物丙二醛（MDA）也相應(yīng)升高，氧自由基的產(chǎn)生導(dǎo)致DNA鏈斷裂，從而激活PARP的活性，活化的PARP在缺血性腦損傷中起重要作用作用。它刺激NAD+耗竭，從而導(dǎo)致ATP耗竭和細(xì)胞死亡。學(xué)者認(rèn)為過氧化反應(yīng)及自由基介導(dǎo)的DNA損傷是由于PA

4、RP被激活所致。越來越多的證據(jù)表明PARP過度激活在細(xì)胞氧化性損傷中起關(guān)鍵作用。
　　 丁苯酞注射液是從芹菜種子中分離出的化學(xué)成分，具有較強(qiáng)的抗腦缺血作用，可阻斷缺血性腦血管病所致腦損傷的多個病理環(huán)節(jié)，本品可通過降低花生四烯酸含量，提高腦血管內(nèi)皮NO和PGI2的水平，抑制谷氨酸的釋放，降低細(xì)胞內(nèi)鈣濃度，抑制自由基和提高抗氧化酶活性等機(jī)制而產(chǎn)生藥效作用。但國內(nèi)有關(guān)丁苯酞注射液神經(jīng)保護(hù)作用的大部分研究都集中在急性腦缺血模型，有關(guān)丁苯

5、酞注射液作用于慢性腦缺血模型的實(shí)驗(yàn)研究報道尚缺乏
　　 方法：用雄性SD大鼠80只，鼠齡為10周，體重200～250g，隨機(jī)分為假手術(shù)對照組（n=20），生理鹽水組（n=20），丁苯酞注射液大劑量組（n=20）（劑量6mg/kg），丁苯酞注射液小劑量組（n=20）（劑量2mg/kg）。每組大鼠行雙側(cè)頸總動脈永久結(jié)扎術(shù)，假手術(shù)組大鼠除不結(jié)扎雙側(cè)頸總動脈外，余處理同生理鹽水組和丁苯酞注射液組。丁苯酞注射液大劑量組手術(shù)第4周后腹腔注射

6、丁苯酞注射液，小劑量組手術(shù)第4周后腹腔注射丁苯酞注射液，均為每日二次，生理鹽水組腹腔注射等劑量生理鹽水，假手術(shù)組不給藥，連續(xù)給予四周。各組大鼠術(shù)后分別在各時間點(diǎn)水迷宮測試后斷頭，在冰盤上快速取腦，去除腦干及小腦，置0～4℃生理鹽水中漂洗，除去血液，濾紙拭干。視交叉后1mm及4mm冠狀切開腦組織，取中間切塊為海馬組織，系列固定、脫水、浸蠟、包埋制成石蠟切片，行HE染色和免疫組化染色觀察海馬病理變化和海馬PARP蛋白表達(dá)變化。取視交叉前腦組

7、織分別檢測SOD活力和MDA含量。運(yùn)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析，采用LSD-t檢驗(yàn)進(jìn)行各組間的兩兩比較，P<0.05表示有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果：（1）各組大鼠存活情況：假手術(shù)組死亡9只，生理鹽水組死亡12只，死亡率分別為45％和60％。丁苯酞注射液大、小劑量組各死亡11只，死亡率為55％。各組存活大鼠作為研究對象。（2）水迷宮試驗(yàn)：生理鹽水組大鼠學(xué)習(xí)、記憶成績顯著下降，表現(xiàn)為尋找平臺潛伏期時間延長，明顯高于

8、假手術(shù)組（P<0.05），丁苯酞注射液大、小劑量組分別與生理鹽水組比較，學(xué)習(xí)、記憶成績均顯著改善（P<0.05），與假手術(shù)組相比，丁苯酞注射液組仍有所下降（P<0.05），丁苯酞注射液大劑量組與丁苯酞注射液小劑量組比較，學(xué)習(xí)、記憶成績均顯著改善（P<0.05）。（3）海馬HE染色：假手術(shù)組大鼠海馬CA1區(qū)錐體細(xì)胞排列較致密整齊，胞漿內(nèi)尼氏體豐富，核大而圓，核仁明顯，偶有神經(jīng)元細(xì)胞變性和壞死；相比之下，生理鹽水組大鼠海馬CA1區(qū)錐體細(xì)胞排

9、列松散，層次不清，有細(xì)胞缺失現(xiàn)象，出現(xiàn)炎性細(xì)胞浸潤，胞體變小，核固縮，胞質(zhì)濃染，丁苯酞大、小劑量組神經(jīng)元變性、死亡較生理鹽水組減輕，正常神經(jīng)元數(shù)目較生理鹽水組多；丁苯酞小劑量組較大劑量組神經(jīng)元細(xì)胞缺失、核固縮現(xiàn)象更明顯。（4）海馬CA1區(qū)PARP蛋白表達(dá)變化：假手術(shù)組海馬CA1區(qū)僅見極少量陽性神經(jīng)元；生理鹽水組可見大量陽性神經(jīng)元意義，排列松散，胞體變小，核固縮，陽性細(xì)胞累計(jì)光密度（IOD）值高于假手術(shù)組（P<0.05），丁苯酞注射液大、

10、小劑量組海馬CA1區(qū)均可見有大量PARP陽性神經(jīng)元分布，陽性物質(zhì)主要位于胞漿內(nèi)，胞核也有少量表達(dá)，細(xì)胞排列較整齊緊密，呈棕黃色，胞體較大，圓形或橢圓形，有的可見突起；與假手術(shù)組相比，丁苯酞注射液大、小劑量組陽性神經(jīng)元IOD值增高（P<0.05）；與生理鹽水組相比陽性神經(jīng)元IOD值降低（P<0.05）。丁苯酞注射液大劑量組海馬CA1區(qū)陽性神經(jīng)元IOD值與丁苯酞注射液小劑量組相比降低（P<0.05）。（5）SOD、MDA測定結(jié)果情況：與假手

11、術(shù)組相比，生理鹽水組前腦組織SOD活力下降，MDA含量增加（P<0.05）。與生理鹽水組相比，丁苯酞注射液大、小劑量組SOD活力有所增加，MDA含量有所下降（P<0.05）。與丁苯酞注射液小劑量組相比，丁苯酞注射液大劑量組組SOD活力明顯增加，MDA含量明顯下降（P<0.05）。
　　 結(jié)論：（1）本實(shí)驗(yàn)動物模型采用較為常用的雙側(cè)頸總動脈永久性結(jié)扎，保證鼠腦不完全性缺血，與人類慢性腦低灌注相似。通過水迷宮試驗(yàn)證實(shí)了模型大鼠存在學(xué)

12、習(xí)和記憶功能障礙，丁苯酞注射液可減輕大鼠的學(xué)校記憶障礙。（2）采用免疫組織化學(xué)方法，證實(shí)了在慢性腦低灌注狀態(tài)下大鼠海馬組織PARP表達(dá)增加，可能參與了慢性腦低灌注的代償與適應(yīng)機(jī)制。分別采用黃嘌呤氧化法和硫代巴比妥酸顯色法測定2-VO大鼠前腦組織SOD活性及MDA含量，證實(shí)了2-VO后腦組織SOD活性下降，MDA含量增加。丁苯酞注射液治療后大鼠海馬組織PARP表達(dá)明顯減少，前腦組織SOD活性明顯增強(qiáng)，MDA含量明顯下降，表明丁苯酞注射液可