慢性腦低灌注狀態(tài)大鼠腦組織線粒體結(jié)構(gòu)和功能改變及丁苯酞注射液對其影響.pdf

1、目的：血管性癡呆（vascular dementia VD）已經(jīng)成為中老年人群中的常見病、多發(fā)病。VD突出的臨床特點(diǎn)是學(xué)習(xí)、記憶等認(rèn)知功能下降，伴或不伴神經(jīng)功能缺損的癥狀和體征。目前，血管性癡呆的發(fā)病機(jī)制尚未完全明確，治療也仍以控制病情、對癥治療、加強(qiáng)護(hù)理為主，尚無特殊有效的根治方法。因此，探索VD的發(fā)病機(jī)理，制定合理的治療方案，是醫(yī)學(xué)領(lǐng)域研究的重要課題。VD病因之一可能與慢性低灌注狀態(tài)所造成的腦缺血缺氧有關(guān)。所謂慢性腦低灌注狀態(tài)是高血

2、壓、腦動脈硬化引起的腦動脈狹窄所致的腦組織長期低于生理閾值而出現(xiàn)的慢性缺血性神經(jīng)系統(tǒng)損害的一種病理狀態(tài)，是VD、AD（Alzheimer's disease AD）和Binswanger病等多種疾病發(fā)展過程中的一個共同病理過程。
　　 大量研究表明，在低灌注狀態(tài)及低代謝狀態(tài)下認(rèn)知功能可發(fā)生減退，而腦部自由基代謝的紊亂是低灌注時產(chǎn)生腦實(shí)質(zhì)和腦微血管系統(tǒng)損害的重要的可能機(jī)制。線粒體既是機(jī)體產(chǎn)生氧自由基的主要細(xì)胞器，又是細(xì)胞進(jìn)行能量代

3、謝的主要場所。線粒體內(nèi)部結(jié)構(gòu)是氧自由基損傷的首要目標(biāo)。因此，線粒體結(jié)構(gòu)和功能的異?？赡茉赩D的發(fā)病過程中起關(guān)鍵性作用。
　　 近年來，臨床上有關(guān)使用丁基苯酞對腦缺血具有神經(jīng)保護(hù)作用，已引起了人們廣泛關(guān)注。丁基苯（dl-n-butylphthalide d1-NBP）是源于天然的化學(xué)合成藥物，藥理學(xué)實(shí)驗表明有良好的抗腦缺血和腦保護(hù)作用，尤其是對急性局灶性缺血后腦神經(jīng)元線粒體形態(tài)和功能具有保護(hù)作用。目前，有關(guān)丁基苯酞神經(jīng)保護(hù)作用的大

4、部分研究都集中在急性缺血模型，有關(guān)作用于慢性腦低灌注模型的實(shí)驗研究報道尚缺乏。本實(shí)驗通過能較好模擬人類慢性腦低灌注的結(jié)扎大鼠雙側(cè)頸總動脈的動物模型，通過水迷宮試驗測試大鼠學(xué)習(xí)記憶受損情況，行透射電鏡觀察線粒體形態(tài)變化，用分光光度法測定大鼠腦線粒體ATP酶活性，超氧化物岐化酶（superoxide dismutase SOD）活性，丙二醛（malondialdehyde MDA）含量，并探討丁苯酞注射對其影響的藥理機(jī)制，以期能為臨床治療血

5、管性認(rèn)知功能障礙提供一個新思路。
　　 方法：用雄性SD大鼠55只，月齡3～4個月，起始體重280～340g，隨機(jī)分為假手術(shù)對照組（n=10），生理鹽水對照組（n=15），丁苯酞注射液高劑量組（n=15），丁苯酞注射液低劑量組（n=15）。每組大鼠行雙側(cè)頸總動脈永久結(jié)扎術(shù)，假手術(shù)組大鼠除不結(jié)扎雙側(cè)頸總動脈外，余處理同生理鹽水組和丁苯酞注射液組。丁苯酞注射液高劑量組手術(shù)第4周后腹腔注射丁苯酞注射液，（劑量6mg/kg），每日二次。

6、丁苯酞注射液低劑量組手術(shù)第4周后腹腔注射丁苯酞注射液，（劑量2mg/kg），每日二次。生理鹽水組腹腔注射等劑量生理鹽水，假手術(shù)組不給藥，連續(xù)給予四周。各組大鼠在水迷宮測試后，隨機(jī)各取2只，1％的戊巴比妥鈉麻醉后，立即斷頭在冰盤上快速取腦，取一側(cè)顳葉皮層約1mm×1mm×2 mm，放入磷酸緩沖的4％戊二醛溶液固定，1％鋨酸中后固定，脫水透明，環(huán)氧樹脂包埋，超薄切片，電鏡觀察、照相。末次給藥后，動物均禁食12h，斷頭，在冰盤上快速取腦，提取

7、線粒體，并懸浮于EDTA-蔗糖Tris-HCl緩沖液中?？捡R斯亮藍(lán)法測定蛋白濃度。調(diào)節(jié)蛋白含量至1mg/ml。分別測定Na+-K+-ATP酶活力、SOD活力和MDA含量。運(yùn)用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行單因素方差分析，采用LSD-t檢驗進(jìn)行各組間的兩兩比較，P<0.05表示有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 結(jié)果：（1）各組大鼠存活情況：假手術(shù)組死亡0只，生理鹽水組死亡5只，死亡率為33.3％。丁苯酞注射液低劑量組、丁苯酞注射液高劑量組分別死

8、亡4只、5只，死亡率分別為26.7％和33.3％。各組存活大鼠作為研究對象。（2）水迷宮試驗：生理鹽水組大鼠學(xué)習(xí)、記憶成績顯著下降，表現(xiàn)為尋找平臺潛伏期時間延長，明顯高于假手術(shù)組（p<0.05）。丁苯酞注射液低劑量組、丁苯酞注射液高劑量組分別與生理鹽水組比較，學(xué)習(xí)、記憶成績均顯著改善（p<0.05）。丁苯酞注射液低劑量組、丁苯酞注射液高劑量組分別與與假手術(shù)組比較，學(xué)習(xí)、記憶成績均有所下降，但無顯著性差異（P>0.05）。丁苯酞注射液高劑

9、量組與丁苯酞注射液低劑量組相比學(xué)習(xí)、記憶成績無明顯差別（p>0.05）。（3）線粒體超微結(jié)構(gòu)改變：假手術(shù)組線粒體超微結(jié)構(gòu)清楚，無明顯異常改變。生理鹽水組線粒體大部分嵴融合消失，線粒體水腫，有的線粒體雙層單位膜消失，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)脫顆粒，神經(jīng)元胞質(zhì)水腫，細(xì)胞器明顯減少。丁苯酞注射液高劑量組線粒體接近于正常，未見線粒體嵴斷裂、空泡增多等，有的出現(xiàn)粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔擴(kuò)大、線粒體肥大等可逆性損傷。丁苯酞注射液低劑量組線粒體形態(tài)基本規(guī)則，大多數(shù)嵴完整，排列

10、緊密規(guī)律。（4）線粒體ATP酶活性測定結(jié)果情況：與假手術(shù)組相比，生理鹽水組線粒體ATP酶活性明顯下降（p<0.05）。與生理鹽組相比，丁苯酞注射液低劑量組線粒體ATP酶活性顯著增加（p<0.05）。與生理鹽水組相比，丁苯酞注射液高劑量組線粒體ATP酶活性亦顯著增加（p<0.05）。丁苯酞注射液低劑量組與丁苯酞注射液高劑量組相比ATP酶活性無明顯差異（p>0.05）。（5）SOD、MDA測定結(jié)果情況：與假手術(shù)組相比，生理鹽水組線粒體SOD

11、活力下降，MDA含量增加（p<0.05）。與生理鹽水組相比丁苯酞注射液低劑量組SOD活力有所增加，MDA含量有所下降（p<0.05）。與生理鹽水組相比，丁苯酞注射液高劑量組SOD活力明顯增加，MDA含量明顯下降（p<0.01）。與丁苯酞注射液低劑量組相比，丁苯酞注射液高劑量組SOD活力，MDA含量均無明顯差異（p>0.05）。
　　 結(jié)論：（1）本實(shí)驗采用雙側(cè)頸總動脈永久性結(jié)扎成功復(fù)制慢性腦低灌注大鼠模型（occlusion o

12、f bilateral2-VO），水迷宮試驗證實(shí)了模型大鼠學(xué)習(xí)和記憶能力下降，進(jìn)一步證實(shí)模型可靠，透射電鏡觀察可見大鼠神經(jīng)元線粒體超微結(jié)構(gòu)有明顯改變。（2）慢性腦低灌注大鼠線粒體SOD活性下降，MDA含量增高，提示線粒體氧化損傷可能是VD的發(fā)病機(jī)制之一。（3）慢性腦低灌注大鼠線粒體ATP酶活性下降。提示能量代謝障礙可能是VD的發(fā)病機(jī)制之一。（4）通過丁苯酞注射液治療，慢性腦低灌注大鼠學(xué)習(xí)記憶能力明顯高于對照組，病理學(xué)進(jìn)一步證實(shí)可減輕線粒