慢性腦低灌注狀態(tài)大鼠腦組織線粒體結(jié)構(gòu)和功能改變及丁苯酞注射液對(duì)其影響.pdf

1、目的：血管性癡呆（vascular dementia VD）已經(jīng)成為中老年人群中的常見(jiàn)病、多發(fā)病。VD突出的臨床特點(diǎn)是學(xué)習(xí)、記憶等認(rèn)知功能下降，伴或不伴神經(jīng)功能缺損的癥狀和體征。目前，血管性癡呆的發(fā)病機(jī)制尚未完全明確，治療也仍以控制病情、對(duì)癥治療、加強(qiáng)護(hù)理為主，尚無(wú)特殊有效的根治方法。因此，探索VD的發(fā)病機(jī)理，制定合理的治療方案，是醫(yī)學(xué)領(lǐng)域研究的重要課題。VD病因之一可能與慢性低灌注狀態(tài)所造成的腦缺血缺氧有關(guān)。所謂慢性腦低灌注狀態(tài)是高血

2、壓、腦動(dòng)脈硬化引起的腦動(dòng)脈狹窄所致的腦組織長(zhǎng)期低于生理閾值而出現(xiàn)的慢性缺血性神經(jīng)系統(tǒng)損害的一種病理狀態(tài)，是VD、AD（Alzheimer's disease AD）和Binswanger病等多種疾病發(fā)展過(guò)程中的一個(gè)共同病理過(guò)程。
　　 大量研究表明，在低灌注狀態(tài)及低代謝狀態(tài)下認(rèn)知功能可發(fā)生減退，而腦部自由基代謝的紊亂是低灌注時(shí)產(chǎn)生腦實(shí)質(zhì)和腦微血管系統(tǒng)損害的重要的可能機(jī)制。線粒體既是機(jī)體產(chǎn)生氧自由基的主要細(xì)胞器，又是細(xì)胞進(jìn)行能量代

3、謝的主要場(chǎng)所。線粒體內(nèi)部結(jié)構(gòu)是氧自由基損傷的首要目標(biāo)。因此，線粒體結(jié)構(gòu)和功能的異?？赡茉赩D的發(fā)病過(guò)程中起關(guān)鍵性作用。
　　 近年來(lái)，臨床上有關(guān)使用丁基苯酞對(duì)腦缺血具有神經(jīng)保護(hù)作用，已引起了人們廣泛關(guān)注。丁基苯（dl-n-butylphthalide d1-NBP）是源于天然的化學(xué)合成藥物，藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)表明有良好的抗腦缺血和腦保護(hù)作用，尤其是對(duì)急性局灶性缺血后腦神經(jīng)元線粒體形態(tài)和功能具有保護(hù)作用。目前，有關(guān)丁基苯酞神經(jīng)保護(hù)作用的大

4、部分研究都集中在急性缺血模型，有關(guān)作用于慢性腦低灌注模型的實(shí)驗(yàn)研究報(bào)道尚缺乏。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)能較好模擬人類(lèi)慢性腦低灌注的結(jié)扎大鼠雙側(cè)頸總動(dòng)脈的動(dòng)物模型，通過(guò)水迷宮試驗(yàn)測(cè)試大鼠學(xué)習(xí)記憶受損情況，行透射電鏡觀察線粒體形態(tài)變化，用分光光度法測(cè)定大鼠腦線粒體ATP酶活性，超氧化物岐化酶（superoxide dismutase SOD）活性，丙二醛（malondialdehyde MDA）含量，并探討丁苯酞注射對(duì)其影響的藥理機(jī)制，以期能為臨床治療血

5、管性認(rèn)知功能障礙提供一個(gè)新思路。
　　 方法：用雄性SD大鼠55只，月齡3～4個(gè)月，起始體重280～340g，隨機(jī)分為假手術(shù)對(duì)照組（n=10），生理鹽水對(duì)照組（n=15），丁苯酞注射液高劑量組（n=15），丁苯酞注射液低劑量組（n=15）。每組大鼠行雙側(cè)頸總動(dòng)脈永久結(jié)扎術(shù)，假手術(shù)組大鼠除不結(jié)扎雙側(cè)頸總動(dòng)脈外，余處理同生理鹽水組和丁苯酞注射液組。丁苯酞注射液高劑量組手術(shù)第4周后腹腔注射丁苯酞注射液，（劑量6mg/kg），每日二次。

6、丁苯酞注射液低劑量組手術(shù)第4周后腹腔注射丁苯酞注射液，（劑量2mg/kg），每日二次。生理鹽水組腹腔注射等劑量生理鹽水，假手術(shù)組不給藥，連續(xù)給予四周。各組大鼠在水迷宮測(cè)試后，隨機(jī)各取2只，1％的戊巴比妥鈉麻醉后，立即斷頭在冰盤(pán)上快速取腦，取一側(cè)顳葉皮層約1mm×1mm×2 mm，放入磷酸緩沖的4％戊二醛溶液固定，1％鋨酸中后固定，脫水透明，環(huán)氧樹(shù)脂包埋，超薄切片，電鏡觀察、照相。末次給藥后，動(dòng)物均禁食12h，斷頭，在冰盤(pán)上快速取腦，提取

7、線粒體，并懸浮于EDTA-蔗糖Tris-HCl緩沖液中。考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定蛋白濃度。調(diào)節(jié)蛋白含量至1mg/ml。分別測(cè)定Na+-K+-ATP酶活力、SOD活力和MDA含量。運(yùn)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析，采用LSD-t檢驗(yàn)進(jìn)行各組間的兩兩比較，P<0.05表示有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果：（1）各組大鼠存活情況：假手術(shù)組死亡0只，生理鹽水組死亡5只，死亡率為33.3％。丁苯酞注射液低劑量組、丁苯酞注射液高劑量組分別死

8、亡4只、5只，死亡率分別為26.7％和33.3％。各組存活大鼠作為研究對(duì)象。（2）水迷宮試驗(yàn)：生理鹽水組大鼠學(xué)習(xí)、記憶成績(jī)顯著下降，表現(xiàn)為尋找平臺(tái)潛伏期時(shí)間延長(zhǎng)，明顯高于假手術(shù)組（p<0.05）。丁苯酞注射液低劑量組、丁苯酞注射液高劑量組分別與生理鹽水組比較，學(xué)習(xí)、記憶成績(jī)均顯著改善（p<0.05）。丁苯酞注射液低劑量組、丁苯酞注射液高劑量組分別與與假手術(shù)組比較，學(xué)習(xí)、記憶成績(jī)均有所下降，但無(wú)顯著性差異（P>0.05）。丁苯酞注射液高劑

9、量組與丁苯酞注射液低劑量組相比學(xué)習(xí)、記憶成績(jī)無(wú)明顯差別（p>0.05）。（3）線粒體超微結(jié)構(gòu)改變：假手術(shù)組線粒體超微結(jié)構(gòu)清楚，無(wú)明顯異常改變。生理鹽水組線粒體大部分嵴融合消失，線粒體水腫，有的線粒體雙層單位膜消失，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)脫顆粒，神經(jīng)元胞質(zhì)水腫，細(xì)胞器明顯減少。丁苯酞注射液高劑量組線粒體接近于正常，未見(jiàn)線粒體嵴斷裂、空泡增多等，有的出現(xiàn)粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔擴(kuò)大、線粒體肥大等可逆性損傷。丁苯酞注射液低劑量組線粒體形態(tài)基本規(guī)則，大多數(shù)嵴完整，排列

10、緊密規(guī)律。（4）線粒體ATP酶活性測(cè)定結(jié)果情況：與假手術(shù)組相比，生理鹽水組線粒體ATP酶活性明顯下降（p<0.05）。與生理鹽組相比，丁苯酞注射液低劑量組線粒體ATP酶活性顯著增加（p<0.05）。與生理鹽水組相比，丁苯酞注射液高劑量組線粒體ATP酶活性亦顯著增加（p<0.05）。丁苯酞注射液低劑量組與丁苯酞注射液高劑量組相比ATP酶活性無(wú)明顯差異（p>0.05）。（5）SOD、MDA測(cè)定結(jié)果情況：與假手術(shù)組相比，生理鹽水組線粒體SOD

11、活力下降，MDA含量增加（p<0.05）。與生理鹽水組相比丁苯酞注射液低劑量組SOD活力有所增加，MDA含量有所下降（p<0.05）。與生理鹽水組相比，丁苯酞注射液高劑量組SOD活力明顯增加，MDA含量明顯下降（p<0.01）。與丁苯酞注射液低劑量組相比，丁苯酞注射液高劑量組SOD活力，MDA含量均無(wú)明顯差異（p>0.05）。
　　 結(jié)論：（1）本實(shí)驗(yàn)采用雙側(cè)頸總動(dòng)脈永久性結(jié)扎成功復(fù)制慢性腦低灌注大鼠模型（occlusion o

12、f bilateral2-VO），水迷宮試驗(yàn)證實(shí)了模型大鼠學(xué)習(xí)和記憶能力下降，進(jìn)一步證實(shí)模型可靠，透射電鏡觀察可見(jiàn)大鼠神經(jīng)元線粒體超微結(jié)構(gòu)有明顯改變。（2）慢性腦低灌注大鼠線粒體SOD活性下降，MDA含量增高，提示線粒體氧化損傷可能是VD的發(fā)病機(jī)制之一。（3）慢性腦低灌注大鼠線粒體ATP酶活性下降。提示能量代謝障礙可能是VD的發(fā)病機(jī)制之一。（4）通過(guò)丁苯酞注射液治療，慢性腦低灌注大鼠學(xué)習(xí)記憶能力明顯高于對(duì)照組，病理學(xué)進(jìn)一步證實(shí)可減輕線粒