丁基苯酞對(duì)慢性腦缺血老齡大鼠腦組織MCX3和AIF表達(dá)的影響.pdf

1、背景和目的
　　 慢性腦缺血是一個(gè)常見的慢性病理生理過程,是多種因?yàn)橐鸬哪X血管狹窄或者低灌注,導(dǎo)致腦血流低于生理需要,引起全腦或者區(qū)域性的腦功能障礙(例如不同程度的記憶力減退、智力下降、頭暈、頭痛、失眠等),并且常常與血管性癡呆(vascular dementia,VD)、阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)等多種疾病伴隨發(fā)生。目前,大多數(shù)國家已經(jīng)進(jìn)入老齡化社會(huì),世界人口正在加速老化,慢性腦缺血相關(guān)性疾

2、病隨之增多,因此,揭示慢性腦缺血損傷的具體機(jī)制,提出有效治療措施愈發(fā)重要。
　　 近年研究發(fā)現(xiàn)鈉鈣交換體3(sodium-calcium exchanger3,NCX3)在神經(jīng)系統(tǒng)疾病中發(fā)揮重要作用。凋亡誘導(dǎo)因子(apoptosis-inducing factor,AIF)能夠誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,其凋亡方式不依賴caspases。丁基苯酞(dl-butylphthalide,NBP)對(duì)缺血性腦血管病有較好的治療作用。
　　 丁

3、基苯酞能否通過影響NCX3和AIF蛋白對(duì)慢性腦缺血組織發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用目前尚未見報(bào)道。本文旨在觀察丁基苯酞對(duì)慢性腦缺血老齡大鼠腦組織中NCX3和AIF蛋白表達(dá)的影響,探討丁基苯酞對(duì)慢性腦缺血組織的神經(jīng)保護(hù)機(jī)制,為慢性腦缺血的臨床治療提供理論依據(jù)。
　　 材料和方法：
　　 清潔級(jí)雄性Wistar大鼠80只,12-14月齡,體質(zhì)量350-450g,隨機(jī)分為4組,適應(yīng)性飼養(yǎng)7天經(jīng)Morris水迷宮測(cè)試合格后用于實(shí)驗(yàn)。A組:對(duì)

4、照組(假手術(shù)+溶劑)；B組:模型組(手術(shù)+溶劑)；C組:小劑量NBP治療組(手術(shù)+小劑量NBP+溶劑)；D組:大劑量NBP治療組(手術(shù)+大劑量NBP+溶劑)。永久性結(jié)扎大鼠雙側(cè)頸總動(dòng)脈(BCAL),制備慢性腦缺血?jiǎng)游锬Ｐ?對(duì)照組只分離雙側(cè)頸總動(dòng)脈,不結(jié)扎,余同模型組；操作時(shí)保持動(dòng)物體溫在(37.5±0.5)℃。模型制備后2個(gè)月,Morris水迷宮測(cè)試學(xué)習(xí)和記憶功能。A、B組給予溶劑灌胃,C、D組分別按60mg/kg/d、120mg/kg

5、/d NBP灌胃。各組連續(xù)灌胃1月后,再次經(jīng)Morris水迷宮檢測(cè)學(xué)習(xí)和記憶功能,之后麻醉大鼠,夾閉腹主動(dòng)脈,經(jīng)心臟快速灌注生理鹽水和多聚甲醛,斷頭取腦,固定、脫水、透明、包埋。冠狀位切片,片厚5μm。HE染色、免疫組化染色,光鏡下閱片,彩色病理圖像分析儀采集圖像,圖像分析系統(tǒng)分析圖像,記錄大鼠海馬與皮層組織形態(tài)學(xué)改變,以及NCX3與AIF平均積分光密度值,數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差((x)±s)表示。采用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行分析,多組間比較

6、采用單因素方差分析,兩組間比較采用LSD-t檢驗(yàn),檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。
　　 結(jié)果：
　　 1一般行為學(xué):術(shù)后大鼠精神差,納差,行動(dòng)遲緩。隨后A、D、C、B組大鼠精神漸漸好轉(zhuǎn),飲食恢復(fù)正常。
　　 2學(xué)習(xí)和記憶功能觀察:術(shù)前各組大鼠逃避潛伏期和跨越平臺(tái)次數(shù)比較,差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；各組模型制作(BCAL)后2個(gè)月,B組較A組逃避潛伏期明顯延長,跨越平臺(tái)次數(shù)明顯減少,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.0

7、5)；BCAL后3個(gè)月,C組和D組較B組逃避潛伏期明顯減少,跨越平臺(tái)次數(shù)明顯增加,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),D組較C組逃避潛伏期減小,跨越平臺(tái)次數(shù)有所增加,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
　　 3 HE染色:各組均沒有明顯缺血梗死灶,A組大鼠海馬及顳葉皮層神經(jīng)元大部分形態(tài)正常,偶爾發(fā)現(xiàn)變性和死亡細(xì)胞；B組神經(jīng)元出現(xiàn)缺血性改變,大部分神經(jīng)元消失,胞核不規(guī)則、固縮、碎裂,有的溶解,胞漿內(nèi)可見空穴,膠質(zhì)細(xì)胞增多；C組大鼠海

8、馬及顳葉皮層神經(jīng)元消失減少,可見部分變性和死亡神經(jīng)元,膠質(zhì)細(xì)胞較B組減少；D組雖然在大鼠海馬和顳葉皮層可以發(fā)現(xiàn)小部分變性和死亡神經(jīng)元,但是其組織形態(tài)較B組有明顯的好轉(zhuǎn),較C組也有部分改善。
　　 4 NCX3免疫組化染色:各組大鼠腦組織切片顯示NCX3蛋白的免疫反應(yīng)產(chǎn)物呈棕黃色或棕褐色著色,主要分布在神經(jīng)元胞膜和胞漿。慢性腦缺血后,大鼠海馬和顳葉皮層中NCX3蛋白水平下降,經(jīng)NBP治療后,NCX3水平有所上升,但在大劑量NBP治

9、療后,NCX3水平上升更明顯。大鼠海馬和顳葉皮層中NCX3蛋白在A、B、C、D組的表達(dá)水平如下:海馬:132.84±3.04,118.64±5.90,123.48±3.64,127.06±3.96；皮層:148.37±4.84,114.44±8.14,127.51±11.51,147.61±5.14。在海馬中,單因素方差分析F值為28.77,P<0.01；在皮層中,F值為61.20,P<0.01。在海馬與顳葉皮層中,B組NCX3蛋白水平

10、比A組下降(P<0.05),C組或D組NCX3蛋白水平比B組增高(P<0.05),D組NCX3比C組增高(P<0.05),兩組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 5 AIF免疫組化染色:AIF蛋白免疫反應(yīng)產(chǎn)物呈棕黃色或棕褐色著色,主要分布于神經(jīng)元胞漿和胞核；部分細(xì)胞核濃染,染色較胞漿深。慢性腦缺血后,大鼠海馬和顳葉皮層中AIF蛋白水平上升,經(jīng)NBP治療后,AIF水平有所下降,但是經(jīng)大劑量NBP治療后AIF下降水平更明顯。大鼠海馬和顳葉皮

11、層中AIF蛋白在A、B、C、D組的表達(dá)水平如下:海馬:108.91±8.91,154.91±8.49,131.59±5.09,115.23±6.19；皮層:93.76±6.56,145.71±4.52,131.46±8.77,123.71±11.07。在海馬中,單因素方差分析F值為101.85,P<0.01,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；在皮層中F值為103.93,P<0.01,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在海馬和皮層中,B組AIF蛋白水平比A組增高(P<0