丁基苯酞對慢性腦缺血老齡大鼠腦組織TRPM2和EndoG的影響.pdf

1、背景和目的：
　　 慢性腦缺血是大腦長期處于低灌注的一種病理狀態(tài)，它可導(dǎo)致腦細(xì)胞氧和葡萄糖供應(yīng)不足，引起一系列神經(jīng)功能障礙。隨著世界上老齡人口所占比率不斷上升，慢性腦缺血及其伴隨性疾病逐漸增多，引起的認(rèn)知減退和退行性神經(jīng)系統(tǒng)疾病對生活質(zhì)量和社會(huì)經(jīng)濟(jì)造成重大影響。故而，探討慢性腦缺血損傷的發(fā)病機(jī)制，提出有效的預(yù)防和治療措施迫在眉睫。
　　 瞬時(shí)感受器電位M2型(transient receptor potential me

2、lastain2，TRPM2)通道是近年來新發(fā)現(xiàn)的非谷氨酸依賴的陽離子通道，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中均有表達(dá)，在缺血缺氧損害及各種有害因素的作用下，細(xì)胞膜上的TRPM2通道被激活，并介導(dǎo)鈣離子的出入胞活動(dòng)，導(dǎo)致鈣超載，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。TRPM2作為新發(fā)現(xiàn)的陽離子通道，在缺血性神經(jīng)系統(tǒng)疾病中的作用成為當(dāng)前研究的熱點(diǎn)之一。
　　 核酸內(nèi)切酶G（endonuclease G，EndoG）是一種鈣離子依賴性內(nèi)切酶，其誘導(dǎo)凋

3、亡的方式不依賴caspases途徑。在慢性腦缺血損傷中，細(xì)胞內(nèi)的鈣超載以及缺血過程中產(chǎn)生的tBid、Bax能夠誘導(dǎo)EndoG自線粒體中釋放到包漿中，并隨即轉(zhuǎn)位至胞核中，引起線粒體斷裂，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。
　　 丁基苯酞(dl-butylphthalide，NBP)對急性腦缺血具有較好的療效，但在慢性腦缺血中是否通過影響TRPM2和EndoG而發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用尚未見報(bào)道。本文旨在觀察丁基苯酞對慢性腦缺血老齡大鼠腦組織中TRPM2和En

4、doG蛋白表達(dá)的影響，深入了解丁基苯酞對慢性腦缺血腦組織的神經(jīng)保護(hù)作用，為慢性腦缺血的有效預(yù)防和治療提供理論新的思路。
　　 材料和方法
　　 選取80只質(zhì)量為450-550g的清潔級(jí)Wister大鼠，7天的適應(yīng)性飼養(yǎng)，經(jīng)水迷宮測試合格后用于試驗(yàn)。大鼠隨機(jī)分為4組，每組20只，A組：對照組（假手術(shù)）；B組：模型組（手術(shù)+溶劑）；C組：缺血丁基苯酞低劑量治療組（手術(shù)+低劑量+溶劑）；D組：缺血丁基苯酞高劑量治療組（手術(shù)+高

5、劑量+溶劑）。采用雙側(cè)頸總動(dòng)脈永久結(jié)扎(BCAL)，建立慢性腦缺血?jiǎng)游锬Ｐ?，術(shù)后2個(gè)月，morris水迷宮測試大鼠學(xué)習(xí)和記憶功能。A組和B組予以溶劑（消毒花生油）灌胃，C組和D組分別予以丁基苯酞60mg/kg/d、120mg/kg/d灌胃。灌胃1個(gè)月后，再次經(jīng)morris水迷宮測試大鼠學(xué)習(xí)和記憶功能，然后麻醉大鼠，開胸暴露心臟，以生理鹽水200ml經(jīng)心臟加壓快速?zèng)_洗，驅(qū)除血管內(nèi)血液，斷頭取腦，置于4％多聚甲醛內(nèi)固定24小時(shí)，常規(guī)脫水、透

6、明、浸蠟、包埋。冠狀位切片，片厚4um，HE染色觀察腦組織形態(tài)學(xué)變化，免疫組化(SP)法染色檢測TRPM2、EndoG的表達(dá)變化。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差((?)±s)表示，SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，多組間比較采用單因素方差分析(One-way.ANOVA)，兩組間比較采用LSD-t檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)為α=0.05。
　　 結(jié)果
　　 1．實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的一般行為觀察
　　 術(shù)前大鼠表現(xiàn)活潑，反應(yīng)敏捷，能自主攝食和飲水，

7、術(shù)后早期，B、C、D各組大鼠精神萎靡，食欲不振，少動(dòng)，易激惹，A組大鼠較術(shù)前無明顯變化，術(shù)后7天，各組基本情況緩慢好轉(zhuǎn)。
　　 2．學(xué)習(xí)和記憶功能觀察
　　 術(shù)前各組大鼠逃避潛伏期和跨越平臺(tái)次數(shù)比較，差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)；各組模型制作(BCAL)后2個(gè)月，B組較A組逃避潛伏期明顯延長，跨越平臺(tái)次數(shù)明顯減少，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);BCAL后3個(gè)月，C組和D組逃避潛伏期縮短，跨越平臺(tái)次數(shù)有所增加，

8、差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 3．HE染色
　　 各組腦組織的顳葉皮層和海馬區(qū)域均未發(fā)現(xiàn)明顯的梗死性病灶，A組大鼠海馬及顳葉皮層神經(jīng)元神經(jīng)元層次豐富，大部分形態(tài)正常，偶見變性壞死細(xì)胞；B組海馬及顳葉皮層僅可見少量形態(tài)正常的神經(jīng)元，神經(jīng)元大部分變性、消失；C組海馬及顳葉皮層神經(jīng)元與B組相比消失減少，正常神經(jīng)元數(shù)量增多；D組海馬及顳葉皮層變性和死亡的神經(jīng)元較B組明顯恢復(fù)。
　　 4.TRPM2免疫組化染

9、色
　　 TRPM2蛋白免疫反應(yīng)產(chǎn)物顯示為棕黃色或棕褐色著色，大部分定位于神經(jīng)元包膜和胞漿中。A組皮層和海馬僅可見少量TRPM2蛋白表達(dá)；B組TRPM2蛋白陽性產(chǎn)物顯著增多；C組：TRPM2蛋白陽性產(chǎn)物較B組有所減少；D組TRPM2蛋白陽性產(chǎn)物較B組明顯減少。在海馬中，單因素方差分析F值為127.115，P＜0.01，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；在皮層中，F(xiàn)值為310.046，P＜0.01，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 5．EndoG

10、免疫組化染色
　　 EndoG蛋白免疫反應(yīng)產(chǎn)物顯示為棕黃色或棕褐色著色，定位于神經(jīng)元胞漿和胞核中。A組皮層和海馬僅可見少量EndoG蛋白表達(dá)；B組EndpG蛋白陽性產(chǎn)物顯著增多；C組和D組EndoG蛋白陽性產(chǎn)物較B組減少，其中D組下降較為明顯。在海馬中，單因素方差分析F值為80.292，P＜0.01，四組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義：在皮層中F值為49.959，P＜0.01，四組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)論
　　 1．