舒肝驅(qū)毒方對HSC活化增殖及其相關(guān)細胞因子作用的研究.pdf

1、肝纖維化是一切慢性肝病共同的病理學基礎，是涉及多種細胞、細胞因子、細胞外基質(zhì)(Extracellularmatrix，ECM)及其降解酶類、細胞凋亡等多個復雜因素的病理生理過程。肝星狀細胞(HSC)是肝臟中的一種非實質(zhì)細胞，其對肝臟的ECM產(chǎn)生、生長因子合成、基質(zhì)重建以及竇孔改變等生理過程均可產(chǎn)生影響。很多的單味中藥和中藥復方，能夠間接或直接地保護肝臟，治療肝纖維化。作為治療肝纖維化的篩選藥物，自擬方舒肝驅(qū)毒方是一個很好的選擇。

2、　　目的：
　　研究舒肝驅(qū)毒方對HSC的活化增殖及相關(guān)細胞因子網(wǎng)絡的作用，以期揭示舒肝驅(qū)毒方抗纖維化的分子機制。
　　方法：
　　1舒肝驅(qū)毒方對HSC增殖及分泌ECM的影響
　　1.1繪制HSC-T6的自然生長曲線
　　將液氮中凍存的HSC-T6細胞株進行復蘇，在恒溫箱中，培養(yǎng)到細胞呈單層致密狀時，用胰蛋白酶消化之后，進行傳代，在細胞生長穩(wěn)定后，用MTT的方法，繪制HSC-T6的生長曲線。
　　1.2

3、舒肝驅(qū)毒方對HSC-T6增殖的影響
　　細胞培養(yǎng)方法同前面，分別加入舒肝驅(qū)毒方高劑量、中劑量、低劑量組，用MTT法，檢測細胞生長情況。
　　1.3舒肝驅(qū)毒方對ECM合成的影響
　　采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應(RT-PCR)檢測Ⅰ、Ⅲ型膠原mRNA，酶聯(lián)免疫法(ELISA)和放射免疫法(RIA)分別檢測Ⅰ型膠原和透明質(zhì)酸含量。
　　2舒肝驅(qū)毒方對相關(guān)細胞因子網(wǎng)絡的調(diào)節(jié)作用
　　2.1舒肝驅(qū)毒方對轉(zhuǎn)化生長因子(T

4、GF)-β1的抑制作用
　　舒肝驅(qū)毒方對HSC-T6細胞TGF-β1mRNA的影響用RT-PCR檢測，對HSC-T6細胞TGF-β1蛋白的影響用WesternBlot法檢測，對TGF-β1受體的影響采用流式細胞技術(shù)檢測。舒肝驅(qū)毒方對TGF-β1的下游效應遞質(zhì)結(jié)締組織生長因子(CTGF)mRNA的影響用RT-PCR檢測。對AngⅡ刺激HSC活化TGF-β1mRNA的抑制作用用RT-PCR檢測，對AngⅡ刺激HSC活化堿性成纖維生長因

5、子(bFGF)表達的抑制作用用免疫組化法檢測。用RT-PCR檢測舒肝驅(qū)毒方對IFN抑制HSC活化TGF-β1mRNA的促進作用。
　　2.2舒肝驅(qū)毒方對血小板源性生長因子(PDGF)的抑制作用
　　舒肝驅(qū)毒方對HSC-T6細胞PDGFmRNA的影響用RT-PCR檢測，對HSC-T6細胞PDGF蛋白的影響用WesternBlot法檢測，對PDGF受體的影響采用流式細胞技術(shù)檢測。舒肝驅(qū)毒方對胰島素樣生長因子(IGF)mRNA的影

6、響用RT-PCR檢測。
　　2.3舒肝驅(qū)毒方對血管緊張素(Ang)Ⅱ刺激HSC活化Ca2+效應的抑制作用
　　舒肝驅(qū)毒方對AngⅡ刺激HSC活化Ca2+效應的抑制作用采用激光掃瞄共焦顯微鏡(LSCM)檢測。
　　結(jié)果：
　　1舒肝驅(qū)毒方對HSC增殖及分泌ECM的影響
　　1.1舒肝驅(qū)毒方對HSC-T6增殖的影響
　　1.2舒肝驅(qū)毒方對ECM合成的影響
　　2舒肝驅(qū)毒方對相關(guān)細胞因子網(wǎng)絡的調(diào)節(jié)作用

7、
　　2.1舒肝驅(qū)毒方對TGF-β1的抑制作用
　　2.1.1舒肝驅(qū)毒方對乙醛作用下HSC-T6細胞TGF-β、CTGFmRNA和TGF-β及其受體的抑制作用
　　乙醛組對TGF-β蛋白表達有明顯促進作用，各舒肝驅(qū)毒方組對TGF-β蛋白表達，無論在24h還是72h，則均有非常明顯的抑制作用。24h時以舒肝驅(qū)毒方高劑量組最為明顯，舒肝驅(qū)毒方中劑量組次之，舒肝驅(qū)毒方低劑量組再次之;72h時以舒肝驅(qū)毒方高劑量組最為明顯，舒肝

8、驅(qū)毒方低劑量組次之，舒肝驅(qū)毒方中劑量組再次之。提示舒肝驅(qū)毒方對乙醛作用下的HSC-T6細胞TGF-β蛋白表達有明顯的抑制作用，且這種抑制作用有可能與劑量成正比。
　　對照組TGF-β1受體表達非常微弱，乙醛組對TGF-β1受體表達有明顯促進作用;各舒肝驅(qū)毒方組對TGF-β1受體表達均有明顯的抑制作用，但舒肝驅(qū)毒方高、中、低劑量組間不存在遞進關(guān)系。提示乙醛可顯著刺激HSC細胞TGF-β1受體表達，舒肝驅(qū)毒方對乙醛作用下的HSC-T6

9、細胞TGF-β1受體表達有明顯的抑制作用，但這種抑制作用可能并不與劑量成正比。
　　2.1.2舒肝驅(qū)毒方對AngⅡ刺激HSC活化TGF-β1mRNA、bFGF的抑制作用
　　AngⅡ組對TGF-βmRNA有一定促進作用，但與對照組比較，差異無顯著性意義(P＞0.05)。各舒肝驅(qū)毒方組對TGF-βmRNA則均有明顯的抑制作用，與AngⅡ組比較，高、中劑量組差異均有顯著性意義(P＜0.05)，而低劑量組僅有抑制趨勢，差異并無顯著

10、性意義(P＞0.05)。提示AngⅡ可能存在一定的刺激HSC-T6細胞TGF-βmRNA作用，但不甚明顯;而舒肝驅(qū)毒方對AngⅡ作用下的HSC-T6細胞TGF-βmRNA抑制作用較為明顯，并且這種抑制作用與藥物劑量成正比。
　　AngⅡ組、對照組、各舒肝驅(qū)毒方組均未見bFGF的陽性表達。
　　2.1.3舒肝驅(qū)毒方對干擾素IFN抑制HSC活化的促進作用
　　IFN組對TGF-βmRNA有明顯的抑制作用，與對照組比較，差異

11、有顯著性意義(P＞0.05);而舒肝驅(qū)毒方各劑量組與對照組比較，差異無顯著性意義(P＞0.05)。舒肝驅(qū)毒方高、中劑量組與IFN組比較，差異有顯著性意義(P＜0.05);而舒肝驅(qū)毒方低劑量組與IFN組比較，差異則無顯著性意義(P＞0.05)。提示IFN確實有強烈的抑制TGF-βmRNA效果;但舒肝驅(qū)毒方對這一效果不但沒有協(xié)同促進作用，反而對這一效果可能有一定的抑制作用。
　　2.2舒肝驅(qū)毒方對PDGF的抑制作用
　　舒肝驅(qū)毒

12、方高劑量組對PDGFmRNA、IGFmRNA有較明顯的抑制作用，與對照組比較，差異有顯著性意義(P＜0.05)，與舒肝驅(qū)毒方高、中劑量組比較，差異也有顯著性意義(P＜0.05)。但舒肝驅(qū)毒方高、中劑量組未表現(xiàn)出抑制作用(P＞0.05)。提示舒肝驅(qū)毒方在低劑量對HSC-T6細胞PDGFmRNA和IGFmRNA有明顯的抑制作用。
　　2.3舒肝驅(qū)毒方對AngⅡ刺激HSC活化Ca2+的抑制作用
　　LSCM下Ca2+熒光成像的HS

13、C-T6細胞仍可部分表現(xiàn)普通倒置顯微鏡下的形態(tài)學特征，AngⅡ組Ca2+熒光強度非常明顯，清晰可見;對照組強度也較明顯，稍次子AngⅡ組;舒肝驅(qū)毒方高劑量組強度也較強，稍次于AngⅡ組和對照組，但區(qū)別不甚明顯;舒肝驅(qū)毒方中、低劑量組強度明顯減弱，并可見大量Ca2+噬斑出現(xiàn)。Ca2+熒光強度相對值的統(tǒng)計分析也反應上述結(jié)果。
　　結(jié)論：
　　1舒肝驅(qū)毒方對HSC增殖及分泌細胞外基質(zhì)(ECM)的影響
　　舒肝驅(qū)毒方對HSC-

14、T6細胞Ⅰ型、Ⅲ型膠原mRNA表達抑制作用較為明顯;HSC-T6分泌Ⅰ型膠原作用的研究也印證了上述結(jié)果;而對于這一抑制作用的產(chǎn)生，舒肝驅(qū)毒方可能存在最好的劑量[舒肝驅(qū)毒方中劑量（10-4mol/L）組]。舒肝驅(qū)毒方對透明質(zhì)酸分泌的抑制作用可能存在，但不顯著。
　　2舒肝驅(qū)毒方對相關(guān)細胞因子網(wǎng)絡的調(diào)節(jié)作用
　　加入乙醛刺激后的HSC-T6細胞TGF-βmRNA、CTGFmRNA有所增加，表明乙醛可刺激HSC增殖，導致纖維結(jié)締組

15、織增生和降解失去平衡，肝臟ECM異常沉積，是酒精性肝纖維化發(fā)生的關(guān)鍵因素。舒肝驅(qū)毒方對TGF-βmRNA、CTGFmRNA均有非常明顯的抑制作用，并且呈現(xiàn)劑量依賴模式;且TGF-β、CTGF具有相關(guān)系的變化趨勢。舒肝驅(qū)毒方對TGF-β蛋白及其受體表達均有明顯的抑制作用，其中在蛋白表達的抑制作用方面，與對TGF-βmRNA影響一致的呈現(xiàn)一定的劑量依賴模式。在TGF-β受體的抑制作用方面，效果也較為顯著，但不存在劑量依賴模式。舒肝驅(qū)毒方對H

16、SC-T6細胞TGF-β、CTGF細胞因子的序貫抑制作用，是其參與抗肝纖維化細胞因子網(wǎng)絡的重要切入點。本研究證明，舒肝驅(qū)毒方也可通過這一環(huán)節(jié)來起到抗肝纖維化的作用。IFN-γ對TGF-βmRNA有明顯的抑制作用，但舒肝驅(qū)毒方對IFN-γ的這一抑制效果不但沒有協(xié)同促進作用，反而可能有一定的抑制作用。
　　舒肝驅(qū)毒方對PDGF、IGFmRNA均有明顯的抑制作用，這種抑制作用可能與劑量有相關(guān)性，且PDGF、IGF具有相關(guān)系的變化趨勢。舒

17、肝驅(qū)毒方組對PDGF蛋白表達的明顯抑制作用也呈現(xiàn)出一定的劑量依賴的模式，與RT-PCR研究結(jié)果一致。舒肝驅(qū)毒方也可通過影響PDGF及IGF來參與抗肝纖維化細胞因子網(wǎng)絡的調(diào)控。AngⅡ還可能存在一定的刺激HSC-T6細胞活化Ca2+的效應，但不甚明顯。這可能與AngⅡ刺激作用有限有關(guān)，也可能是由于其他因素導致HSC生物轉(zhuǎn)化功能下降的原因。舒肝驅(qū)毒方對AngⅡ作用下的HSC-T6細胞活化Ca2+效應有明顯的抑制作用，可能是由于舒肝驅(qū)毒方可以