依達(dá)拉奉對UUO大鼠模型MDA、p-ERK1-2、NF-κBp65及CollagenⅢ表達(dá)的影響.pdf

1、目的：腎間質(zhì)纖維化(Renal Interstitial Fibrosis, RIF)以細(xì)胞外基質(zhì)(Extracellular Matrix, ECM)過度沉積為主要病理特征，是各種病因所致慢性腎臟病(Chronic Kidney Disease, CKD)的共同病理過程。
　　腎間質(zhì)纖維化是一個極其復(fù)雜的病理過程：在各種損傷因素作用下，腎臟局部激活氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)，腎臟固有細(xì)胞的細(xì)胞因子水平、代謝、甚至結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，使ECM生

2、成和降解失衡，最終導(dǎo)致ECM在腎間質(zhì)過度沉積。ECM代謝失衡主要包括兩方面：一是多種來源細(xì)胞轉(zhuǎn)分化為肌成纖維細(xì)胞(Myofibroblast, MFB)，其是RIF的主要效應(yīng)細(xì)胞，可分泌Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原，表達(dá)α-平滑肌肌動蛋白(α-Smooth Muscle Actin,α-SMA)；二是部分細(xì)胞因子抑制ECM降解。
　　活性氧(reactive oxygen species, ROS)具有為配對電子，是一組具有高化學(xué)反應(yīng)活性的

3、小分子物質(zhì)。正常生理狀態(tài)下，機(jī)體內(nèi)活性氧維持在低水平狀態(tài)。病理狀態(tài)下，超過生理水平的活性氧不僅可以直接氧化蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、DNA等生物大分子，還可以作為信號分子導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)外信號通路的異常，影響細(xì)胞正常代謝和功能。其中，脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物丙二醛(malondialdehyde，MDA)濃度可反映ROS水平。
　　細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶1/2(extracellular signal-regulated kinase1/2, ERK1/2)隸屬

4、于絲裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase, MAPK)家族，活化形式為磷酸化 ERK1/2(phospho-extracellular signal-regulated kinase1/2, p-ERK1/2)，主要通過介導(dǎo)細(xì)胞膜和細(xì)胞核之間的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)而參與細(xì)胞增殖、分化、轉(zhuǎn)分化、凋亡等。
　　核因子-κB(nuclear factor kappa B, NF-κB)是一種核蛋白，包括

5、5個亞型：NF-κB1(p50/p105)、NF-κB2(p52/p100)、Rel(p65)、RelB和 C-κB1，主要參與基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié)，許多蛋白質(zhì)基因的啟動子和增強(qiáng)子均存在與其結(jié)合的序列。致纖維化因子，如單核細(xì)胞趨化因子-1(monocyte chemoattractant protein,MCP-1)、細(xì)胞間粘附因子(intercellular cell adhesionmolecule-1, ICAM-1)、血管細(xì)胞粘附因子

6、(vascular cell adhesion molecule1, VCAM-1)等表達(dá)均受NF-κB調(diào)控。
　　依達(dá)拉奉(edaravone, EDA)是一種自由基清除劑，可抑制細(xì)胞的氧化損傷。臨床上主要用于急性腦梗的治療。而氧化損傷在腎間質(zhì)纖維化中具有重要的作用。國內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)，依達(dá)拉奉可降低抗氧化應(yīng)激水平緩解肝纖維化和肺纖維化的加重。在腎臟疾病中，依達(dá)拉奉可減輕缺血/再灌注相關(guān)的腎損傷。然而，依達(dá)拉奉能否通過減輕氧化損傷來

7、延緩腎間質(zhì)纖維化的進(jìn)展？國內(nèi)外尚未見類似報道。本實驗擬在單側(cè)輸尿管梗阻(Unilateral Ureteral Obstruction，UUO)大鼠模型基礎(chǔ)上給予依達(dá)拉奉干預(yù)，觀察其對脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物丙二醛(malonaldehyde, MDA)、p-ERK1/2、p65、Collagen-Ⅲ水平的影響，借此探討依達(dá)拉奉對腎間質(zhì)纖維化的作用。
　　方法：選取54只清潔劑雄性SD大鼠(體重200±20g)，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，完全隨機(jī)分

8、為3組，每組18只：假手術(shù)組(Sham組)、UUO組和依達(dá)拉奉組(EDA組)。在實驗整個期間，所有大鼠自由進(jìn)食水。
　　UUO組在無菌條件下，以水合氯醛(4ml/kg)通過腹腔注射麻醉，在左腹部距腹中線約1.5cm、肋下約1cm處行縱行切口，逐層分離，探及左腎后沿腎臟下極分離出左側(cè)輸尿管，在輸尿管中上1/3出用4-0號線結(jié)扎兩處，并從中間斷。術(shù)畢，用生理鹽水沖洗腹腔，檢查有無重要臟器損傷及活動性出血，最后逐層關(guān)閉腹腔。EDA組手術(shù)

9、同UU組；Sham組不結(jié)扎和剪斷輸尿管，余手術(shù)過程同UUO組。
　　三組均于術(shù)前1天開始給藥。EDA組給予依達(dá)拉奉3.75mg/kg/d腹腔注射，UUO組和Sham組給予等體積生理鹽水腹腔注射。
　　各組分別于術(shù)后3天、7天、14天隨即選取6只大鼠分三批處死，取出梗阻側(cè)腎臟分為4部分保存：1部分保存在于固定液中，3部分保存于-80℃。采用蘇木素伊紅染色、Masson染色觀察各組腎組織病理變化。采用免疫組織化學(xué)法對腎組織p-E

10、RK1/2、NF-κB p65、Ccollege-Ⅲ進(jìn)行半定量分析。采用分光光度計法測定組織勻漿MDA。
　　實驗數(shù)據(jù)用SPSS20.0統(tǒng)計分析軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理，結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差( x±S)表示，多/單因素方差分析對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，P<0.05表示結(jié)果有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　結(jié)果：
　　1.光鏡下HE染色
　　Sham組：第3、7、14天腎小球、腎小管及間質(zhì)未觀察到明顯異常。
　　UUO組：術(shù)后3天可觀察到腎

11、小管輕度擴(kuò)張及間質(zhì)少量胞浸潤；術(shù)后7天腎小管擴(kuò)張程度及間質(zhì)炎癥細(xì)胞浸潤加重，腎小管上皮細(xì)胞變性、壞死，腎間質(zhì)寬度增加；術(shù)后14天可見較多腎小管萎縮，腎小管基底膜彌漫增厚、皺縮，伴有不同程度斷裂。
　　EDA組：術(shù)后腎小管間質(zhì)觀察到與 UUO組類似改變，較同時相點UUO組略有減輕。
　　2.光鏡下Masson染色
　　Sham組：第3、7、14天均未觀察到明顯異常。
　　UUO組：術(shù)后第3天可觀察到腎小管輕度擴(kuò)張，

12、腎小管間質(zhì)部位可見藍(lán)色膠原纖維沉積；術(shù)后第7天、14天，腎小管擴(kuò)張及膠原纖維沉積程度呈隨梗阻時間進(jìn)行性加重。
　　EDA組：術(shù)后第3、7、14天，腎小管擴(kuò)張程度、腎間質(zhì)膠原纖維沉積度呈隨梗阻時間進(jìn)行性加重，但輕于同時相點UUO組。
　　3.腎組織勻漿中MDA水平
　　Sham組：第3、7、14天MDA水平無統(tǒng)計學(xué)差異(P均＞0.05)。
　　UUO組：術(shù)后第3、7、14天MDA水平隨梗阻時間延長進(jìn)行性升高，(P均

13、＜0.05)。其水平均高于同時相點Sham組(P均＜0.05)。
　　EDA組：術(shù)后第3、7、14天腎組織勻漿MDA水平進(jìn)行性升高，(P均＜0.05)。其水平均高于同時相點Sham組(P均＜0.05)。術(shù)后第3天時相點，EDA組和UUO組水平無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)；術(shù)后第7、14天時相點，EDA組水平均略低于UUO組，具有統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05)。
　　4.腎組織中p-ERK1/2免疫組織化學(xué)染色
　　Sham

14、組：可觀察到p-ERK1/2主要在腎小管上皮細(xì)胞核內(nèi)表達(dá)。第3、7、14天表達(dá)水平無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)。
　　UUO組：可觀察到p-ERK1/2主要在腎小管上皮細(xì)胞核內(nèi)表達(dá)，其表達(dá)水平隨梗阻時間延長而增高(P均＜0.05)，高于同時相點 Sham組(P均＜0.05)。
　　EDA組：可觀察到p-ERK1/2主要在腎小管上皮細(xì)胞核內(nèi)表達(dá)，其表達(dá)水平隨梗阻時間延長而增高(P均＜0.05)，高于同時相點 Sham組(P＜0

15、.05)，略低于同時相點UUO組(P均＜0.05)。
　　5.腎組織中NF-κB p65免疫組織化學(xué)染色
　　Sham組：可觀察到NF-κB p65主要在腎小管上皮細(xì)胞核內(nèi)表達(dá)。第3、7、14天表達(dá)水平無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)。
　　UUO組：可觀察到NF-κB p65主要在腎小管上皮細(xì)胞核內(nèi)表達(dá)，其表達(dá)水平隨梗阻時
　　EDA組：可觀察到NF-κB p65在腎小管上皮細(xì)胞核內(nèi)表達(dá)，其表達(dá)水平隨梗阻時間延長而

16、增高(P均＜0.05)，高于同時相點 Sham組(P均＜0.05)。略低于同時相點UUO組(P均＜0.05)。
　　6.腎組織中CollagenⅢ免疫組織化學(xué)染色
　　Sham組：第3、7、14天腎小球無明顯表達(dá)，腎小管上皮細(xì)胞僅有基礎(chǔ)水平表達(dá)，無統(tǒng)計學(xué)差異(P均＞0.05)。
　　UUO組：可觀察到腎小管上皮細(xì)胞及腎間質(zhì)表達(dá)水平增加，隨梗阻時間進(jìn)行性加重(P均＜0.5)。其表達(dá)水平均高于同時相點 Sham組(P＜0.

17、05).
　　EDA組：可觀察到腎小管上皮細(xì)胞及腎間質(zhì)表達(dá)水平增加，隨梗阻時間進(jìn)行性加重(P均＜0.05)。其表達(dá)水平均高于同時相點 Sham組(P＜0.05)。術(shù)后第3天，EDA組水平與UUO組無明顯差異(P＞0.05)。術(shù)后第7、14天，EDA組水平略低于UUO組(P＜0.05)
　　結(jié)論：
　　1.氧化應(yīng)激、p-ERK1/2、NF-κB p65通路可能參與了UUO大鼠膜型腎間質(zhì)纖維化的進(jìn)展。
　　2.在UU