人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞介導(dǎo)的肝細(xì)胞生長因子拮抗劑NK4地肝癌的體外抑制作用研究.pdf

1、目的:間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cell，MSCs)作為重要的成體干細(xì)胞之一，免疫原性低，在體內(nèi)能夠向腫瘤遷移、定位，并整合入腫瘤的結(jié)締組織中。干細(xì)胞治療是目前正在探索的腫瘤新型生物治療方法之一，以MSCs作為抗腫瘤因子的遞送載體用于腫瘤治療的嘗試已取得一定進(jìn)展。肝細(xì)胞生長因子拮抗劑NK4具有拮抗肝細(xì)胞生長因子（hepatocyte growth factor, HGF）誘導(dǎo)的腫瘤生長、轉(zhuǎn)移和侵襲以及抑制非HGF/

2、c-Met依賴性的腫瘤血管生成的雙重作用，作為抗腫瘤制劑具有良好的應(yīng)用前景。目前常用腺病毒作為遞送載體介導(dǎo)其發(fā)揮抗腫瘤作用，以MSCs為遞送載體可以避免腺病毒載體直接遞送基因反復(fù)應(yīng)用引起的免疫排斥反應(yīng)。本實驗擬通過體外實驗研究人骨髓MSCs向人高轉(zhuǎn)移肝癌細(xì)胞系MHCC-97H的遷移特性以及通過重組腺病毒載體(recombinant adenoviral vector,rAd)介導(dǎo)NK4修飾的人骨髓MSCs對MHCC-97H細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移

3、的抑制作用及其機制。
　　方法:通過transwell將MSCs與MHCC-97H共培養(yǎng)，分析MSCs體外向肝癌細(xì)胞MHCC-97H的遷移性。以pCR-4-TOPO-HGF為模板，PCR擴增獲得NK4基因，然后克隆入穿梭質(zhì)粒pAdTrack-CMV，再經(jīng)同源重組獲得重組腺病毒質(zhì)粒，293細(xì)胞包裝，獲得重組腺病毒rAd-NK4/GFP，用TCID50法測定病毒滴度，提取病毒基因組PCR鑒定目的基因，Western-blot鑒定目的基

4、因表達(dá);用高滴度的腺病毒rAd-NK4/GFP感染MSCs，獲得帶有NK4的MSCs(rAd-NK4-MSCs)，將rAd-NK4-MSCs與MHCC-97H以1∶1的比例通過transwell進(jìn)行共培養(yǎng)，分別在24h、48 h、72 h用MTT法檢測rAd-NK4-MSCs對MHCC-97H細(xì)胞增殖的抑制作用，在24 h后用結(jié)晶紫染色法檢測rAd-NK4-MSCs對MHCC-97H細(xì)胞轉(zhuǎn)移的抑制作用。為了探究rAd-NK4-MSCs對

5、MHCC-97H增殖和轉(zhuǎn)移的抑制機制，應(yīng)用Western-blot檢測MHCC-97H與rAd-NK4-MSCs共培養(yǎng)后MHCC-97H細(xì)胞HGF/c-Met信號通路關(guān)鍵因子ERK1/2磷酸化水平變化。為了進(jìn)一步探究rAd-NK4-MSCs也可以通過抑制血管生成來抑制腫瘤生長，利用細(xì)胞劃痕實驗檢測了rAd-NK4-MSCs條件培養(yǎng)基對人臍帶血管內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)體外轉(zhuǎn)移的抑制作用。
　　結(jié)果:MSCs遷移實驗結(jié)果表明，體外M

6、SCs具有顯著的向MHCC-97H細(xì)胞的遷移性(P＜0.01)。在構(gòu)建重組腺病毒實驗中，重組腺病毒DNA分子轉(zhuǎn)染293細(xì)胞后，10d左右細(xì)胞出現(xiàn)腫脹、圓縮等典型的病變效應(yīng)（Cytopathic effect，CPE），提取病毒基因組后PCR檢測到目的條帶，Western-blot檢測到NK4基因的表達(dá)，擴增后得到高滴度(0.8×1010 pfu/mL)、有活性的非復(fù)制型重組腺病毒rAd-NK4/GFP，并成功感染MSCs。體外共培養(yǎng)實驗

7、中，MTT結(jié)果表明，在24 h、48 h、72 h時rAd-NK4-MSCs均能顯著抑制MHCC-97H細(xì)胞的體外增殖(P＜0.05)，抑制率隨著時間的延長而增大;結(jié)晶紫染色實驗結(jié)果表明，rAd-NK4-MSCs顯著抑制了MHCC-97H細(xì)胞的體外遷移能力(P＜0.01); Western-blot檢測到ERK1/2磷酸化水平下調(diào)。HUVECs體外遷移抑制實驗中，rAd-NK4-MSCs條件培養(yǎng)基顯著抑制了HUVECs的體外遷移(P＜0